Podríamos reforzar la hipótesis de la existencia de una región promotora que reconoce un complejo protéico formado por SIN3 y ASH2?
Nuestros resultados demuestran la conservación de algunas secuencias nucleotídicas dentro de la región promotora de genes cuya expresión esta regulada por SIN3 y ASH2 en Drosophila melanogaster. Exactamente 16 de los 22 genes analizados parecen tener una secuencia de 50 nucleotidos bastante conservada en su región promotora, lo cual indica que esta secuencia, o subsecuencias de esta fragmento nucleotídico,ha podido ser conservada por realizar alguna función importate en la supervivencia del organismo.
En el pariente más cercano de D. melanogaster, D. pseudoobscura no podemos ver claramente la conservación de la región. Únicamente 2 de las 21 secuencias promotoras obtenidas han demostrado tener una secuencia de 50 nucleotidos muy similar a las secuencias obtenidas en D. melanogaster .Eso puede ser debido, a diversos factores, puede ser que lo que se conserve sea una secuencia nucleotídica más cortas, o nucleótidos de posiciones puntuales, como se puede ver en los ClustalW.
También podria ser que la desaparición ha podido ser debida a la perdida de función de la sequencia, o también cabe la posibilidad de que una falta de información por nuestra parte, ya que los datos de la sequenciación del genoma de D. pseudobscura es muy reciente, haya dado lugar a la obtención de estos resultados.
Pese a esto los resultados son prometedores, dado que estos dos genes que parecen estar regulados por la secuencia de 50 nucleótidos, presentan una secuencia similar en las regiones promotoras de los genes ortólogos de D. melanogaster como se puede observar en el CLUSTALW.
Con respecto a A. mellifera y A. gambiae, cuya distancia evolutiva es mayor que la de D. pseudobscura con respecto a D. melanogaster, podemos deducir diversos y muy diferentes datos de los resultados obtenidos.
En el caso de A. mellifera las regiones promotoras extraidas han demostrado tener multiples posibles secuencias reguladoras similares a las de D. melanogaster, incluso utilizando un treshold bastante selectivo (T=0.5) en el reconocimiento de estas secuencias de los promotores de A. mellifera.
Los datos de la secuenciaci&oacut;n del genoma de A. mellifera han sido publicados apenas hace dos meses y la información de la que disponemosa actualmente (y durante la realización de nuestro trabajo) es de la secuenciación de scaffolds todavía sin ensamblar.
Este hecho nos ha llevado a que los resultados a partir de los genes ortólogos obtenidos tengan que ser tratados con cierta cautela. En los casos en que hemos identificado fragmentos conservados de transcrito de los 22 genes de D. melanogaster mediante tBLASTx, la región upstream que hemos podido extraer no ha sido lo suficientemente larga. Solo en unos pocos casos hemos podido obtener regiones upstream de 2000 nucleotidos.
Además, el no haber podido identificar el lugar de inicio de transcripción nos ha hecho imposible definir los hits del matscan (obtenidos con la matriz de D. melanogaster sobre los promotores de A. mellifera) candidatos para ser secuencias cis raguladoras.
Aunque podemos intuir una conservación de secuencias nucleotídicas en la región promotora de en los genes ortólogos a los 22 genes de D. melanogaster, necesitarímos m´s información para sacar conclusiones fiables; información de de la anotación de los genes ortólogos, del inicio de transcripción, de la secuencia de las regiones promotoras de los genes...
De esta información algo confusa, en cambio, podríamos sospechar que la secuencia reguladora que estamos queriendo identificar, probablemente tenga menos que 50 nucleótidos y se repita unas pocas veces a lo largo de un pequeño fragmento (100 nucleótidos) cercano al lugar de inicio de la transcripción, pero esta afirmación se ha de tratar con precaución.
En A. gambiae la situación es muy diferente. En este caso la información de la secuenciaci&ocute;n del genoma es muy completa, incluso podemos obtener información de los genes ortólogos de D. melanogaster en bases de datos como Ensembl.
De esta forma hemos obtenido las regiones upstream (2500 nucleótidos) del inicio de transcripción. Ejecutando matscan de la matriz para secuencias de 50 nucleótidos de las regiones promotoras de los 22 genes de D. melanogaster sobre los promotores obtenidos en A. gambiae hemos podido identificar en A. gambiae secuencias nucleotídicas similares a las encontradas en D. melanogaster. De estas 4 sequencias encontradas, 3 de ellas en la región promotora del mismo gen, dos (una en cada gen) están situadas a una distancia razonable del lugarde inicio de transcripción como para poder efectuar una función reguladora. Además estos genes que parecen tener una secuencia que reconoce el complejo formado por SIN3 y ASH2 en A. gambiae, también tienen una probable secuencia reguladora en la región promotora de genes ortólogos de D. melanogaster.
Mediante clustalW hemos comprobado la conservación de la secuencias identificadas de cada promotor con la secuencia del promotor del gen ortólogo entre los dos organismos. La alta conservación, una vez más nos lleva a pensar en la importancia funcional de esta secuencia de 50 nucleótidos o una subsecuencia reflejada entre estos 50 nucleótidos.
Como mejorar los resultados obtenidos, para poder seguir en esta linea de investigación?
Probablemente el desarrollo de diversos proyectos de secuenciación de genomas, nos aporten mucha más información para verificar la existencia de una secuencia reguladora que reconozca el posible complejo protéico formado por SIN3 y ASH2, cuya función es esencial para el desarrollo larvario en D. melanogaster.
Con la información de la que disponemos actualmente también podrímos obtener datos significativos. Por una parte sería interesante verificar la existencia de genes ortólogos que codifiquen proteínas como SIN3 y ASH2 en los organismos analizados ( D. pseudobscure, A. mellifera, A. gambiae ). En caso de obtener estos ortologos, podría ser valioso saber su funció en cada organismo, observando los resultados de mutar estos genes en cada organismo, por ejemplo. Esto nos ayudariía a saber si el mantenimiento de la función en diversos organismos ha sido esencial para la supervivencia, por lo que de haber alguna secuencia reguladora que reconocieran estas proteinas en las regiones promotoras de los genes regulados, también sería imprescindible su conservación. En cierta medida podrímos hacer algo similar por vía computacional, identificando proteínas ortólogas en bases de datos, y comprobando si tienen dominios de unión al DNA (en tal caso también debería haber una secuencia nucleotídica que la reconociera). Este último linia de investigación podrí ser un proyecto de biología estructural, asignatura que cursaremos el proximo trimestre.
Siguiendo un poco la linea que hemos seguido nosotros, podríamos llevar a cabo diversos trabajos. Por una parte podrímos verificar la existencia de la secuencia analizada a lo largo de todo el genoma. Esto nos daría una idea de la posibilidad de encontrarnos con esta secuencia de 50 nucleotidos al azar en las regiones escojidas. Podríamos hacer lo mismo con las matrices obtenidas mediante el meme para cada organismo, de esta forma comprobarímos que la presencia de la secuencia de 50 nucleótidos de D.melanogaster se puede encontrar en otros organismos por razones funcionales y conservativas, en cambio la existencia de las secuencias reflejadas en las matrices de cada organismo, son secuencias que han podido obtenerse al azar. De no ser así podrímos comprobar la similitud de estas secuencias reflejadas en las matrices de cada organismo entre ellas, mediante clustal, de esta forma comprobariamos la similitud de las secuencias aunque no estuvieran reflejadas en la misma matriz.
Con los datos obtenidos hasta ahora, no descartamos la posible existencia de una secuencia que reconozca un posible complejo prot´ico formado por SIN3 y ASH2, por lo que, en definitiva, sería muy útil la comprobación de la existencia de dicha secuencia en el laboratorio.