Selenoproteines

El tBLASTn del genoma de P.tricornitumcontra els diferents queries selenoproteïna Sel T ens ha donat resultats positius amb tots els querys utilitzats, de manera que hem obtingut hits significatius A més, tots els querys alineen en el mateix contig.

Tot i axí, hem fet exonerate amb cada un dels querys, dels quals obtenim resultat en Homo sapiens, Mus musculus i C.elegans 4B. En fer genewise, en canvi, hem obtingut resultats en tots els querys, inclosos els que no ens havien donat cap resultat amb exonerate, fet que es justifica si tenim en compte que genewise és menys exigent. Posteriorment hem fet el TCoffee i hem obtingut alineament de la U o la C (en el cas dels homòlegs amb cisteïna) de la query amb un codó stop.

Així doncs, podem afirmar que hi ha selenoproteïna en aquest genoma. Cal destacar, però, que tot i semblar haver trobat moltes selenoproteïnes (una amb cada query), en realitat només n’hem identificat una ja que estem analitzant cada vegada el mateixa regió del genoma (el mateix contig).

És important destacar el cas de C.elegans 3B , ja que després de no obtenir resultats amb exonerate, vam fer genewise i vam veure que una part de la proteïna predita inicialment havia estat tallada, degut a que el programa havia interpretat com a codó stop un TGA que en realitat és una selenocisteina. Llavors, vam afegir el fragment que faltava a la seqüència proporcionada pel genewise, i en fer TCoffee vam obtenir un molt bon alineament amb la nostra query, que vam confirmar, com en cada cas, fent un BLASTp de la proteïna obtinguda i observant homòlogues en diferents espècies.

El tBLASTn del genoma S.parasitica contra els diferents queries selenoproteïna Sel T ens ha donat bons hits en els casos de Mus musculus, Homo sapiens, C.elegans 3B i 4B. Per tant,en aquest moment, els querys de Anopheles i Drosophila queden ja descartats. D’altra banda, amb els hits seleccionats vam procedir amb l’exonerate i genewise; amb exonerate hem obtingut resultats només en C.elegans mentre que amb genewise n’hem obtingut per tots els queries. En el cas dels C.elegans 3b i 4b observem la cisteïna (es tracta d’un query homòleg) alineada amb un stop, fet que confirma que es tracta de la selenoproteïna. Això ho vam confirmar en obtenir un bon alineament al TCoffee i realitzant el BLASTp de la proteïna obtinguda per comprovar que realment ens surten selenoproteïnes de la mateixa família en vàries espècies. En Mus musculus i Homo sapiens, en canvi, vam observar que la U de la query es trobava fora de l’alineament, és a dir, d’on començava el hit. Per tant, vam haver d’ampliar la seqüència de DNA, la qual no estava inclosa en el tBLASTn i per això el que vam fer és agafar el DNA que codifica per la proteïna predita donada pel genewise i obtenir la seva cadena complementària ja que el hit del genewise era la cadena reversa. Seguidament vam buscar aquest DNA en el document de fastasubseq (regió genòmica) i vam ampliar la seqüència extreta, amb la que repetim el TCoffee. Un cop fet això, veiem que la U de la query alinea amb un gap molt extens, de manera que descartem que sigui la selenoproteïna; per tant aquests queries no ens són útils.

Així doncs, en aquest genoma hem identificat una selenocisteïna, ja que els contigs dels alineaments de C.elegans 3b i 4b són els mateixos, és a dir, que es tracta de la mateixa regió genòmica.

El tBLASTn del genoma d’E.siliculosus contra els diferents queries de la selenoproteïna SelT hem obtingut hits representatius per Homo sapiens, Mus musculus, C.elegans i Drosophila, en canvi no n’hem obtingut cap per Anopheles. Per tant, hem descartat el query d’Anopheles i hem procedit amb els altres per fer exonerate i genewise. En l’exonerate, hem obtingut resultats només per C.elegans 4b, mentre que pels altres queries hem hagut de seguir amb els resultats de genewise.

En el cas d’Homo sapiens, ens hem trobat amb la mateixa situació que amb el genoma de S.parasitica, ja que la U es troba fora de l’alineament, per tant hem hagut d’ampliar la regió genòmica del hit.

Analitzant l'exonerate i el genewise, hem observat que la C o U de la query s’alinea amb un codó stop, de manera que es confirma la presència de la selenoproteïna de la família Sel T. En fer TCoffee obtenim bons alineaments en tots els casos i en fer el BLASTp també trobem proteïnes de la família en espècies diferents. Per tant, tenint en compte que els contigs obtinguts pel tBLASTn és el mateix per cada query, hem confirmat la presència d’aquesta selenoproteïna al genoma.

El tBLASTn del genoma de C.muris contra els diferents queries de la selenoproteïna Sel T, ens ha donat bons hits només per Drosophila i C.elegans 3b . En fer exonerate, no hem obtingut resultats en cap dels dos, però sí en genewise, de manera que hem seguit amb els resultats obtinguts en genewise.
Aquesta vegada ens hem trobat amb el problema que la C es trobava fora de l’alineament en els dos queries per tant hem hagut d’ampliar la regió del DNA en cada cas. Amb C.elegants 3b hem tingut la sort de poder aconseguir la seqüència de DNA que ens faltava la a partir de l’alineament del tBLASTn (sense l’opció -m9). Amb Drosophila, en canvi, hem hagut de realitzar el mateix procés que en Mus musculus i Homo sapiens en el genoma de S.parasitica.

Posteriorment, un cop aconseguida la seqüència adequada, hem fet el t-coffee pels dos queries i hem obtingut bons alineaments en els dos casos, on hem comprovat que la C de la query s’alinea amb una altra C, és a dir, que es tracta d’una proteïna homòloga amb cisteïna; hem identificat una única proteïna ja que els dos queries alineen en la mateixa regió el genoma (mateix contig).

El tBLASTn del genoma de C.parvum amb els diferents queries de Sel T, ens ha donat bons hits en tots els queries excepte Anopheles, el qual ja descartem. En fer l’exonerate amb la resta de queries no hem obtingut resultats en cap d’ells; per tant, seguim amb els resultats obtinguts a partir del genewise.
En el cas de C.elegans 3b també ens hem trobat que la C estava fora de l’alineament, i per tant hem ampliat la regió de DNA per tal de que el hit inclogués la C d’interès.

Seguidament hem fet el TCoffee i hem obtingut bons alineaments en tots els casos, observant en tots ells que la C o la U de la query s’alinea amb una C, demostrant que es tracta d’una proteïna homòloga amb cisteïna. Per confirmar-ho, hem obtingut selenoproteïnes de la mateixa família en fer el BLASTp amb la proteïna predita. Per tant, confirmem que es tracta d’una proteïna homòloga amb cisteïna (la mateixa en tots els queries ja que el contig no varia en cap cas).

El tBLASTn del genoma de T.trahens amb els diferents queries de SelT ens ha donat bons resultats en tots els casos, de manera que hem procedit a fer exonerate amb tots ells. Tot i aixi, només hem obtingut resultats d’exonerate amb Mus musculus, Drosophila i C.elegans 3b i 4b; en els quals observem que la C o la U (en el cas del query Mus musculus) s’alineen amb un codó stop (TGA), fet que ens suggereix que probablement es tracta d’una selenoproteïna. Igualment, però, hem realitzat genewise per tots els queries i seguidament TCoffee, que ens ha confirmat l’alineament de la C o la U de la query amb un codó stop.
Cal destacar que analitzant els resultats del genewise amb el query d’Anopheles, ens vam trobar, de nou, que la C alineada amb el codó stop estava fora de l’alineament, llavors vam allargar la seqüència de DNA del hit a partir de l’alineament del tBLASTn. Així, finalment vam poder trobar en tots els TCoffees l’evidència de l’alineament de la C o U d’interès amb un codó stop, confirmant que és una selenoproteïna. Aquesta vegada, també es tracta de la mateixa selenoproteïna en tots els queries, ja que el contig per l’alineament de cada query és el mateix en tots els casos.

Finalment hem volgut fer un alineament múltiple entre els diferents selenoproteïnes i homòlegs en cisteïna predits, per tal de poder observar si la regió on hi ha la U o la C és una regió altament conservada. L’alineament en qüestió el podeu visualitzar aquí.

Tal i com es pot observar, hi ha una alta conservació a la regió que implica la selenocisteïna o la cisteïna en el cas dels homòlegs fet que mostra la seva rellevància funcional.