A continuació trobem el protocol general realitzat. A l'apartat de Resultats detallem els passos específics realitzats per a cadascuna de les proteïnes analitzades:
Primer, vam accedir a la pàgina del NCBI amb la finalitat d'aconseguir informació sobre el genoma del nostre organisme a estudiar, el Paramecium tetraurelia; tot i així, cal dir que el genoma no el vàrem extreure d'aquí, sinó que ens el van proporcionar els mateixos professors des de: $/disc8/genomes/P.tetraurelia/genome.fa Un cop ja dins el NCBI, la nostra sorpresa va ser que aquest organisme presenta un codi genètic una mica diferent de l'estàndard; concretament, els codons UAA i UAG que codifiquen normalment per a codó Stop, en Paramecium tetraurelia tots dos codifiquen per a l'aminoàcid àcid glutàmic (Glu o Q). Per aquest motiu, hem hagut de fer servir la comanda –Q 6 en el shell cada vegada que volíem treballar amb el genoma del nostre organisme. D'altra banda, també vàrem haver d'accedir a la base de dades SelenoDB per tal de baixar–nos totes les seqüències en format FASTA de les proteïnes humanes conegudes, així com també les seqüències de la maquinària de síntesi. Cadascuna d'aquestes seqüències baixades, les vàrem guardar fent un emacs: $ nom_selenoproteïna_humana.fa El següent pas va consistir en fer un tblastn de cada selenoproteïna humana i de cada maquinària de síntesi contra el genoma de Paramecium tetraurelia. Per aconseguir-ho, vàrem fer anar la següent ordre al shell: $ blastall –p –Q 6 tblastn –i nom_selenoproteïna_humana.fa –d /disc8/genomes/P.tetraurelia/genome.fa> Mitjançant aquesta comanda podíem guardar l'aliniament entre les dues seqüències d'aminoàcids mentre que amb una altra comanda podíem guardar l'alineament en forma de taula. $ blastall –p –Q 6 tblastn –i nom_selenoproteïna_humana.fa –d /disc8/genomes/P.tetraurelia/genome.fa –m 9 A partir de cada taula, ens vàrem fixar únicament en aquells scaffolds de P.tetraurelia que presentaven un valor de e-value més petit o igual que 1.0. A més, aquests scaffolds havien de formar part d'un aliniament interessant. És a dir, que la selenocisteïna humana (U) estigués aliniada amb un codó Stop (*) o amb una cisteïna (C) de P.tetraurelia, o bé que la cisteïna humana estigués aliniada amb una cisteïna de P. tetraurelia. Cada vegada que volíem seleccionar un scaffold d'interés havíem de fer anar la següent comanda: $ perl ~/Desktop/FastaToTbl.pl /disc8/genomes/P.tetraurelia/genome.fa | awk ‘$1==“scaffold_número”’ | perl ~/Desktop/TblToFasta.pl > nom_selenoproteïna_scaffold_número.fa.> Per a cadascun dels scaffolds seleccionats, la taula anterior també mostrava l'inici i el final en què hi havia hagut més homologia en l'aliniament. Ara bé, en aquells casos en què l'inici fos més gran que el final (perquè la seqüència estava girada), vàrem haver de fer anar la comanda: $ fastarevcomp nom_selenoproteïna_scaffold_número.fa > nom_selenoproteïna_scaffold_número_revcomp.fa A continuació, vàrem extreure un fragment de cadascun dels scaffolds seleccionats agafant aproximadament uns 1000 nucleòtids abans de l'inici (– s) més uns 3000 nucleòtids a partir d'aquests (– l 3000), de tal manera que el tros tallat també contingués des de l'inici fins el final del fragment que el blast havia mostrat amb més homologia. Això últim ho vàrem aconseguir mitjançant la comanda: $ fastasubseq –f nom_selenoproteïna_scaffold_número.fa –s 5472001 –l 3000 > nom_selenoprote&ium;na_scaffold_número_5472001-5475000.fa. Una vegada seleccionat el fragment del scaffold d'interès havíem de predir l'estructura real del gen que codificaria per a la proteïna, és a dir els exons i els introns. Vàrem utilizar el programa GeneWise, el qual compara una seqüència proteica amb una seqüència d'ADN i indica els potencials exons i introns, així com la seqüència aminoacídica i els codons codificants. El problema va ser que els resultats obtinguts amb aquest programa no eran significatius ni raonables. Per aquesta raó vam provar d'utilitzar el programa Exonerate des del shell amb les comandes: $ which exonerate $ exonerate –m p2g –q Selenoproteïna_humana.fa – scaffold_dinterès.fa Cal mencionar que al realitzar el blast i altres tipus d'alineaments, obtenim més codons stop (*) del que seria habitual ja que el codi genètic de Paramecium és diferent al codi genètic estàndard. D'aquesta manera vàrem obtenir una estructura del gen d'interès i una seqüència aminoacídica. A partir d'aquí, amb la comanda fastatranslate vàrem traduir, per separat, cada exó predit. Per tal d'obtenir la seqüència codificant completa, al NCBI vam fer un blast d'aquest fragment de potencial proteïna contra els mRNAs de Paramecium tetraurelia. Vam localitzar la seqüència obtinguda al scaffold d'interès i vam trobar el començament i final de la proteïna (codó metionina i Stop), així com els introns i exons predits a l'Exonerate. Si la proteïna a estudiar es tractava d'una selenoproteïna, també vam localitzar l'element SECIS. Per finalitzar, vam traduir la seqüència completa i vam localitzar el codó Stop o bé la Cys que al començament s'alineaven amb la U de la selenoproteïna humana. Per comprovar que la identitat de la proteïna predita era del 100%, vam realitzar un tblastn de la proteïna de Paramecium tetraurelia contra tot el genoma d'aquest organisme. D'aquesta forma, podem afirmar que la proteïna està present a Paramecium tetraurelia.
Per finalitzar, com a últim pas de tots, vam utilitzar el Clustalw per observar el percentatge d'identitat entre la proteïna de Paramecium i la humana. El Clustalw és un dels programes d'alineament de seqüències més conegut. L'algoritme que utilitza fa alineaments globals, és a dir, considera la similitud en tota l'extensió de les seqüències, contràriament al que fa el Blast.
