Estudi genòmic computacional de la proteïna de fusió AML1/MDS1/EVI1

Alba Bach (alba.bach01@campus.upf.es)
Luis Benjumea (luisfernando.benjumea01@campus.upf.es)

Facultat de Ciències de la Salut i de la Vida
Universitat Pompeu Fabra

INTRODUCCIÓ

El gen AML1/MDS1/EVI1 o AME és un gen quimèric humà generat per la translocació t(3;21)(q26;q22). Es troba involucrat en la progressió de malalties hematopoètiques de cèl·lules mare, com la leucèmia mieloide crònica. El resultat d'aquesta translocació comporta la fusió dels gens AML1, MDS1 i EVI1, que codificaran per un factor de transcripció d'aproximadament 200kDa. La proteïna resultant conté la meitat N-terminal d'AML1, que inclou un domini d'homologia runt, fusionat a una part central de MDS1 i la proteïna entera EVI1, que inclou dominis "zinc-finger". En aquest treball es descriurà detalladament i per separat cada un dels gens que codifiquen la proteïna de fusió.

         El gen AML1 (també anomenat RUNX1 o CBFα2) es troba al cromosoma 21, a la banda q22. Codifica per un factor de transcripció que conté, a la regió N-terminal, un domini d'unió al DNA que és homòleg al gen pair-rule runt de Drosophila. La proteïna AML1 normal és la subunitat d'unió al DNA de l'enhancer CBF (core-binding factor). Funciona com un heterodimer juntament amb CBFβ, subunitat que no s'uneix al DNA però que potencia l'afinitat d'aquesta unió. L'acció conjunta d'AML1 i CBFβ té un paper important en el desenvolupament de l'hematopoesi i vasos sanguinis.

         El gen EVI1 es troba al cromosoma 3, a la banda q26. Codifica per un factor de transcripció que conté "zinc-fingers". Va ser identificat originalment com un lloc d'integració retroviral en cèl·lules mieloides murines tumorals. EVI1 s'expressa normalment en teixits no hematopoètics, menys en les leucèmies mieloides humanes induïdes per la proteïna de fusió AME.

         El gen MDS1 es localitza a la regió upstream del gen EVI1 al cromosoma 3, a la banda q26. No es coneix la seva funció, però ha estat identificat com un gen separat i també com un exó (o exons) previs a EVI1 no descrits. S'ha demostrat que MDS1 existeix en teixits normals, tan com un transcrit únic, com un transcrit normal fusionat amb EVI1. El gen MDS1 afegeix 188 codons addicionals a l'extrem 5' en el marc obert de lectura d'EVI1. Aquesta regió addicional presenta un 40% d'homologia a nivell d'aminoàcids amb el domini PR de la proteïna RIZ (retinoblastoma-interacting zinc-finger). Aquest punt és important perquè com ja s'ha dit la translocació esmentada està implicada en alguns tipus de leucèmia.

ESTRUCTURA GENÒMICA

         A partir de la seqüència proteica que es mostra a continuació, es va realitzar un blastp al NCBI. El resultat ens va indicar que es tractava de la proteïna de fusió AML1-EVI1. Seguidament, es va buscar la seqüència corresponent a aquests gens a ENSEMBL i UCSC. Es va veure que la seqüència donada contenia els tres primers exons del gen AML1, tota la seqüència codificant del gen EVI1, a més d'una regió UTR corresponent a l'exó 2 i una part de l'exó 3 també del gen EVI1. Sorprenentment, la seqüència entre els dos gens (113 aa), no corresponia a cap d'aquests dos. Al realitzar un blastp d'aquesta seqüència desconeguda es va descobrir una tercera proteïna anomenada MDS1. Concretament l'exó 3 de la proteïna en qüestió. A partir d'aquest punt, la proteïna de fusió va a passar a ser AML1/MDS1/EVI1 (AME).

MRIPVDASTSRRFTPPSTALSPGKMSEALPLGAPDAGAALAGKLRSGDRSMVEVLADHPGELVRTDSPNFLCSVLPTHWRCNKTLPIAF
KVVALGDVPDGTLVTVMAGNDENYSAELRNATAAMKNQVARFNDLRFVGRSGRGKSFTLTITVFTNPPQVATYHRAIKITVDGPREPRN
NECVYGNYPEIPLEEMPDADGVASTPSLNIQEPCSPATSSEAFTPKEGSPYKAPIYIPDDIPIPAEFELRESNMPGAGLGIWTKRKIEV
GEKFGPYVGEQRSNLKDPSYGWEILDEFYNVKFCIDASQPDVGSWLKYIRFAGCYDQHNLVACQINDQIFYRVVADIAPGEELLLFMKS
EDYPHETMAPDIHEERQYRCEDCDQLFESKAELADHQKFPCSTPHSAFSMVEEDFQQKLESENDLQEIHTIQECKECDQVFPDLQSLEK
HMLSHTEEREYKCDQCPKAFNWKSNLIRHQMSHDSGKHYECENCAKVFTDPSNLQRHIRSQHVGARAHACPECGKTFATSSGLKQHKHI
HSSVKPFICEVCHKSYTQFSNLCRHKRMHADCRTQIKCKDCGQMFSTTSSLNKHRRFCEGKNHFAAGGFFGQGISLPGTPAMDKTSMVN
MSHANPGLADYFGANRHPAGLTFPTAPGFSFSFPGLFPSGLYHRPPLIPASSPVKGLSSTEQTNKSQSPLMTHPQILPATQDILKALSK
HPSVGDNKPVELQPERSSEERPFEKISDQSESSDLDDVSTPSGSDLETTSGSDLESDIESDKEKFKENGKMFKDKVSPLQNLASINNKK
EYSNHSIFSPSLEEQTAVSGAVNDSIKAIASIAEKYFGSTGLVGLQDKKVGALPYPSMFPLPFFPAFSQSMYPFPDRDLRSLPLKMEPQ
SPGEVKKLQKGSSESPFDLTTKRKDEKPLTPVPSKPPVTPATSQDQPLDLSMGSRSRASGTKLTEPRKNHVFGGKKGSNVESRPASDGS
LQHARPTPFFMDPIYRVEKRKLTDPLEALKEKYLRPSPGFLFHPQMSAIENMAEKLESFSALKPEASELLQSVPSMFNFRAPPNALPEN
LLRKGKERYTCRYCGKIFPRSANLTRHLRTHTGEQPYRCKYCDRSFSISSNLQRHVRNIHNKEKPFKCHLCDRCFGQQTNLDRHLKKHE
NGNMSGTATSSPHSELESTGAILDDKEDAYFTEIRNFIGNSNHGSQSPRNVEERMNGSHFKDEKALVTSQNSDLLDDEEVEDEVLLDEE
DEDNDITGKTGKEPVTSNLHEGNPEDDYEETSALEMSCKTSPVRYKEEEYKSGLSALDHIRHFTDSLKMRKMEDNQYSEAELSSFSTSH
VPEELKQPLHRKSKSQAYAMMLSLSDKESLHSTSHSSSNVWHSMARAAAESSAIQSISHV

SEQÜÈNCIA PROTEICA: proteína de fusió AME.

FIGURA 1. Representació de la proteïna de fusió: En aquesta imatge hi ha representada la unió dels tres gens involucrats en la translocació. S'hi pot veure els diferents exons que conformaran la proteïna de fusió, així com, les diferents regions que s'uneixen i els nucleótids dels extrems exonals. Si mireu atentament es veu la corresponència dels colors de la seqüència proteica amb als colors del dibuix. També es troben diferenciats les parts no codificants d'EVI1 amb diverses entonacions de verd. El codó que codifica per la N marcada de vermell es forma a partir de l'útim nucleòtid de l'exó 3 d'AML1 i els dos primers nucleòtid de l'exó 3 de MDS1.

FIGURA 2. Esquema del procés de fusió resultant de la translocació cromosòmica. En primer lloc podem veure com, per splicing alternatiu, el fragment resultant de la fusió entre EVI1 i MDS1 provoca l'aparició d'un nou domini PR. Aquesta proteïna (MDS1/EVI1) es pot traduïr de forma natural. De manera que quan es produeix la translocació, la meitat N-terminal d'AML1 amb un domini runt s'afegeix a aquesta estructura.

GEN RUNX1/AML1

Taula 1. Característiques de cada un dels transcrits pel gen RUNX1. Si cliqueu en el seu ID podreu veure detalladament l'estructura proteica i nucleotídica del transcrit.

Clustalw alignment transcrits AML1: Clustalw de les proteïnes obtingudes a partir dels diferents transcrits. Si obriu el fitxer podreu observar que hi ha una part comuna al mig que es repeteix a tots els transcrits. Mentre que el principi i el final varien d'un transcrit a l'altre.

GEN MDS1

Nom oficial	Myelodysplasia syndrome 1
Altres noms	PRDM3; MDS1-EVI1
Localització	Cromosoma 3 (3q26.2)
Resum	La proteïna codificada pel gen MDS1 és un factor de transcripció de funció encara desconeguda. S'ha vist que s'expressa com un únic transcrit o com un transcrit unit al gen EVI1.
Transcrits	Segons la base de dades de l'ENSEMBL el gen MDS1 presenta un transcrit diferent del transcrit que descriu VEGA. Només mencionem el transcrit de VEGA ja que és el que ens permet explicar millor la proteïna de fusió.

Taula 2. Característiques del transcrit pel gen MDS1. Si cliqueu en el seu ID podreu veure detalladament l'estructura proteica i nucleotídica del transcrit.

GEN EVI1

Nom oficial	Ecotropic viral integration site 1
Altres noms	PRDM3; MDS1-EVI1; AML1-EVI-1; MGC163392
Localització	Cromosoma 3 (3q26.2)
Resum	El gen EVI1 s'ha vist que s'expressa com un únic transcrit o com un transcrit unit al gen MDS1. MDS1 és un gen petit, que es troba 300-400kb upstream del primer exó d'EVI1. La fusió de MDS1-EVI1 es produeix per un splicing entre l'exó dos de MDS1 cap a l'exó 3 de EVI1. EVI1 té 1051 aminoàcids i és una proteïna d'unió al DNA de 145kDa. Presenta dos dominis amb set i tres sets de repeticions del motiu zinc finger, un domini de repressió entre els dos sets de zinc finger, i un domini acídic a la regió C-terminal. La tranducció de MDS1-EVI1 afageix 188 aminoàcids upstream de l'inici de traducció del tercer exó. 63 aa deriven de la regió no codificant de l'exó 2 i part de la l'exó 3 d'EVI1, i els 125 aa restans provenen del gen MDS1.
Transcrits	Segons la base de dades de ENSEMBL i SWISS-PROT el gen EVI1 presenta dues isoformes o transcrits diferents produits per splicing alternatiu. La primera isoforma codifica per la variant més llarga mentre que la segona isoforma codifica per una variant petita. CCDS3205.1

Taula 3. Característiques de cada un dels transcrits pel gen EVI1. Si cliqueu en el seu ID podreu veure detalladament l'estructura proteica i nucleotídica del transcrit.

GENS ORTÒLEGS

          Desprès de caracteritzar l'estructura genòmica es va realitzar un estudi de l'homologia de cada un dels gens en altres espècies. A partir de la base de dades de l'ENSEMBL, es va obtenir la seqüència proteica i nucleotídica de cada un dels ortòlegs així com el seu % d'homologia. En el cas del gen EVI1, la base de dades de l'ENSEMBL no mostrava cap gen ortòleg. Per això es van buscar a la base de dades de l'UCSC on vam obtenir resultats positius. Una vegada recopilats tots els transcrits, es va realitzar la construcció dels arbres filogenètics per tenir una imatge mès visual de l'homologia de cada gen entre les diferents espècies. Per dur a terme aquestes construccions es van fer servir diverses eines informàtiques com Clustalw, Bioedit i Mega.

Ortòlegs del gen RUNX1

ESPÈCIE	GENEID	% HOMOLOGIA
Aedes aegypti	AAEL006160	52
Anopheles gambiae	ENSANGG00000019555	71
Bos taurus	ENSBTAG00000004742	98
Caenorhabditis elegans	B0414.2	29
Canis familiaris	ENSCAFG00000009596	97
Cavia porcellus	ENSCPOG00000002684	94
Ciona intestinalis	ENSCING00000002253	27
Ciona savignyi	ENSCSAVG00000004072	64
Dasypus novemcinctus	ENSDNOG00000015041	46
Drosophila melanogaster	CG15455	35
Echinops telfairi	ENSETEG00000011313	86
Felis catus	ENSFCAG00000006761	89
Gallus gallus	ENSGALG00000016022	77
Gasterosteus aculeatus	ENSGACG00000015276	48
Loxodonta africana	ENSLAFG00000004290	74
Macaca mulatta	ENSMMUG00000001649	99
Monodelphis domestica	ENSMODG00000021051	90
Mus musculus	ENSMUSG00000022952	95
Ornithorhynchus anatinus	ENSOANG00000011162	65
Oryctolagus cuniculus	ENSOCUG00000013731	98
Oryzias latipes	ENSORLG00000020699	56
Pan troglodytes	ENSPTRG00000013883	100
Rattus norvegicus	ENSRNOG00000001704	94
Takifugu rubripes	SINFRUG00000149207	55
Tetraodon nigroviridis	GSTENG00034595001	80
Tupaia belangeri	ENSTBEG00000000192	77
Xenopus tropicalis	ENSXETG00000014140	84

Taula 4. Llista de les diferents espècies que presenten ortòlegs pel gen RUNX1 humà. Per cada un d'aquests ortòlegs s'indica el seu transcrit ID, amb un enllaç a la pàgina d'on s'han obtingut i el percentatge d'homologia.

Arbre filogenètic dels ortòlegs del gen RUNX1

Arbre 1. Representació filogenètica dels ortòlegs de RUNX1. Blau: mamífers. Lila: aus i amfibis. Verd: peixos. Blau fosc i marró: insectes. Blau cel: nemàtodes. Vermell: ascidies (cordats).

         El gen RUNX1 humà que codifica per un factor de transcripció amb un domini runt presenta una gran varietat de gens ortòlegs en la majoria d'espècies del regne animal. Els gens ortòlegs amb una homologia més elevada corresponen evidentment a mamífers, com Pan troglodytes (100%), Macaca mulatta (99%) i Mus musculus (95%) entre d'altres. Per altra banda, l'homologia es prou elevada en aus i peixos, i mitjana-baixa en invertebrats. Respecte a insectes, s'ha comprovat que presenta homologia amb el gen pair-rule de Drosophila. Segons tots els resultats observats, es pot afirmar que es un gen força conservat al llarg de l'evolució, fet que indica que té un paper molt rellevant en el funcionament cel·lular.

Ortòlegs del gen MDS1

ESPÈCIE	GENEID	% HOMOLOGIA
Bos taurus	ENSBTAG00000020168	93
Canis familiaris	ENSCAFG00000024240	90
Cavia porcellus	ENSCPOG00000012256	91
Dasypus novemcinctus	ENSDNOG00000017489	92
Erinaceus europaeus	ENSEEUG00000010532	89
Felis catus	ENSFCAG00000004548	95
Gasterosteus aculeatus	ENSGACG00000007274	34
Loxodonta africana	ENSLAFG00000010308	93
Macaca mulatta	ENSMMUG00000031567	99
Monodelphis domestica	ENSMODG00000024658	77
Mus musculus	ENSMUSG00000051636	87
Ornithorhynchus anatinus	ENSOANG00000007584	71
Rattus norvegicus	ENSRNOG00000011640	82
Tetraodon nigroviridis	GSTENG00003821001	22
Tupaia belangeri	ENSTBEG00000009672	93
Xenopus tropicalis	ENSXETG00000022835	46

Taula 5. Llista de les diferents espècies que presenten ortòlegs pel gen MDS1 humà. Per cada un d'aquests ortòlegs s'indica el seu transcrit ID, amb un enllaç a la pàgina d'on s'han obtingut i el percentatge d'homologia.

Arbre filogenètic dels ortòlegs del gen MDS1

Arbre 2. Representació filogenètica dels ortòlegs de MDS1. Blau i lila: mamífers. Blau fosc: amfibis. Verd i marrò: peixos.

         El gen MDS1 humà no presenta tants gens ortòlegs com RUNX1, però en presenta a la majoria d'espècies del regne animal, menys en invertebrats. Els gens ortòlegs amb una homologia més elevada corresponen evidentment a mamífers, com Macaca mulatta (99%), Felis catus (95%) i Mus musculus (87%), entre d'altres. Per altra banda, l'homologia es mitjana-baixa en peixos i amfibis. Segons els resultats observats i la informació obtinguda, el gen MDS1 humà no té una funció clara però tot i així ha de ser important en alguna funció cel·lular perquè s'hagi mantingut al llarg de l'evolució.

Ortòlegs del gen EVI1

ESPÈCIE	GENEID	% HOMOLOGIA
Mus musculus	AJ001482	92
Xenopus laevis	AY939893	78
Sus scrofa	AK232131	93

Taula 6. Llista de les diferents espècies que presenten ortòlegs pel gen EVI1 humà. Per cada un d'aquests ortòlegs s'indica el seu transcrit ID, amb un enllaç a la pàgina d'on s'han obtingut i el percentatge d'homologia.

         El gen EVI1 humà gairebé no presenta ortòlegs. Fet evident tenint en compte que es tracta d'un lloc d'integració ecotròpica viral. Nomès es van obtenir tres ortòlegs pel gen EVI1 a partir de la base de dades de l'UCSC, Mus musculus (92%), Xenopus laevis (78%) i Sus scrofa (93%). En diversos estudis es destaca l'elevat grau d'homologia entre els ortòlegs d'humà i ratolí que mantenen conservats els dos dominis zinc-finger d'aquesta proteïna. Per altre banda, en la base de dades HomoloGene (Discover Homologs) de l'NCBI es van trobar possibles gens ortòlegs d'EVI1 en Canis familiaris, Ratus norvegicus, Drosophila melanogaster i Anopheles gambiae. Curiosament també s'ha trobat en aquesta base de dades un gen homòleg similar a la proteina de fusió AML1-EVI1 en Gallus gallus (LOC424997) i Pan troglodytes (LOC460837). En el cas de Gallus gallus presenta una similaritat del 84% a nivell nucleotídic i del 89% a nivell d'aminoàcids.

CARACTERITZACIÓ DE L'EXPRESSIÓ

        La caracterització de l'expressió dels diferents gens es va determinar a partir dels microarrays presents en la base de dades de l'UCSC. Aquesta informació es va comparar amb la referida a diversos articles i fonts digitals com Swiss-Prot. També es va contrastar tota la informació amb les imatges disponibes del VisiGene.

        El gen RUNX1 presenta una expressió en quasibé tots els teixits excepte al cervell. Els seus nivells més elevats es troben en timus, en medul·la òssia i en sang perifèrica. Una de les principals funcions d'AML1 és el desenvolupament de cèl·lules hematopoètiques, de manera que és normal que es trobi tant expressat en aquest teixits com també en malalties de la sang (leucèmies).

En humans, el gen EVI1 s'expressa en molts teixits, com podem veure en els diferents chips d'expressió. Entre d'altres podem destacar l'expressió en ronyons, pulmons, pàncrees i ovaris, on s'han realitzat estudis més detallats per comprovar realment que es dóna aquesta expressió. Per altre banda, en diversos experiments realitzats en ratolins, s'ha determinat una alta expressió en el sistema urinari, en els conductes de Müller, en el pulmó i en el cor, però en canvi, baixos nivels d'expressió en els teixits adults. En aquesta imatge extreta de VisiGene en USCS es pot veure l'expressió de la proteïna EVI1 en el desenvolupament embrionari de ratolins. El seu patró d'expressió sugereix que EVI1 juga un papel important en el desenvolupament del ratolí i podria estar implicat en l'organogènesi, com també en la migració, creixement i diferenciació cel·lular.

       Pel que fa al gen MDS1, els resultats representats en els chips de microarrays indiquen una alta expressió en el sistema nerviòs, que és comuna en els tres tipus de chips. Però aquests resultats són poc concluents ja que no es disposen de cites bibliogràfiques que esmentin la comprovació d'aquesta expressió.

Taula 7. GNF Expression Atlas 2 Data from U133A and GNF1H Chips

Taula 8. Normal Human Tissue cDNA Microarrays

Taula 9. GNF Expression Atlas 1 Human Data on Affy U95 Chips

CARACTERITZACIÓ DE LA REGIÓ PROMOTORA

         Per caracteritzar la regió promotora de cada un dels gens estudiats, es va fer un PROGRAMA PERL basat en la identificació de possibles factors de transcripció a partir d'una seqüència promotora. Aquest programa llegeix un fitxer amb matrius de factors de transcripció (FTs) i un altre fitxer amb una seqüència d'una regió promotora en format FASTA. Posteriorment, mostrarà la llista dels FTs proporcionats amb un p-value per cada FT que ens indicarà la probabilitat de rebutjar erròniament la hipòtesi inicial de que el factor no s'uneix. A partir de les dades obtingudes, se seleccionarà un conjunt de factors de transcripció amb una alta probabilitat d'actuar sobre la seqüència promotora. Per contrastar i ampliar els resultats, es va fer sevir el pograma PROMO per la detecció de factors de transcripció regulables coneguts (filtres: FTs humans i llocs d'unió a FTs humans). Un cop recopilada tota la informació s'han realitzat diverses taules per les regions promotores de cada un dels diferents gens.

FTs de les seqüències promotores del gen AML1

El gen AML1, com s'ha vist a l'apartat de l'estrucutra genòmica, presenta diversos transcrits. Conseqüentment hi ha 3 regions promotores diferents per les quals s'ha fet l'estudi per separat.

Taula 10. Resultats del programa perl. Es mostren els FTs més significatius amb una S* elevada i un p-value inferior a 0,05.

Taula 11. Resultats del PROMO pels FTs identificats amb el nostre programa.

Taula 12. Resultats del PROMO. S'indica els FTs i el nombre d'aparicions de cada un. Per descartar FTs poc probables, només s'han considerat com significatius aquells que presentaven una dissimilaritat inferior a 5 i un RE equally inferior a 0,1.

         Els resultats obtinguts en el nostre programa coincideixen amb els resultats obtinguts en el PROMO. Els FTs AP-1 i RXR-α són FTs amb un alt potencial d'actuar sobre la seqüència promotora 1 d'AML1. Com que es tracta de la seqüència promotora del trascrit principal, presenta, a part dels dos anteriors, molts d'altres possibles FTs.

Taula 13. Resultats del programa perl. Es mostren els FTs més significatius amb una S* elevada i un p-value inferior a 0,05.

Taula 14. Resultats del PROMO pels FTs identificats amb el nostre programa.

Taula 15. Resultats del PROMO. S'indica els FTs i el nombre d'aparicions de cada un. Per descartar FTs poc probables, només s'han considerat com significatius aquells que presentaven una dissimilaritat inferior a 5 i un RE equally inferior a 0,1.

         Els resultats obtinguts en el nostre programa coincideixen amb els resultats obtinguts en el PROMO. El FT HIF-1 té un alt potencial d'actuar sobre la seqüència promotora 2 d'AML1. Com es pot apreciar a la taula 15, aquesta regió promotora no pertany al transcrit principal i per tant presenta menys possibles FTs.

Taula 16. Resultats del programa perl. Es mostren els FTs més significatius amb una S* elevada i un p-value inferior a 0,05.

Taula 17. Resultats del PROMO pels FTs identificats amb el nostre programa.

Taula 18. Resultats del PROMO. S'indica els FTs i el nombre d'aparicions de cada un. Per descartar FTs poc probables, només s'han considerat com significatius aquells que presentaven una dissimilaritat inferior a 5 i un RE equally inferior a 0,1.

         Els resultats obtinguts en el nostre programa coincideixen amb els resultats obtinguts en el PROMO. El FT RXR-α té un alt potencial d'actuar sobre la seüència promotora 3 d'AML1. Com es pot apreciar a la taula 18, aquesta regió promotora tampoc pertany al transcrit principal i per tant presenta també menys possibles FTs en comparació amb la seqüència promotora 1.

FTs de la seqüència promotora del gen EVI1

Taula 19. Resultats del programa perl. Es mostren els FTs més significatius amb una S* elevada i un p-value inferior a 0,05.

Taula 20. Resultats del PROMO pels FTs identificats amb el nostre programa.

Taula 21. Resultats del PROMO. S'indica els FTs i el nombre d'aparicions de cada un. Per descartar FTs poc probables, només s'han considerat com significatius aquells que presentaven una dissimilaritat inferior a 5 i un RE equally inferior a 0,1.

         Respecte a la seqüència promotora d'EVI1, hem vist que entre els possibles FTs que ens ha proporcionat el PROMO estàn també els possibles FTs identificats pel programa perl. Aquests FTs són NF-AT1 i RXR-α. Tot i així, s'ha de destacar que el programa PROMO utilitza una matriu diferent que l'arxiu que fem llegir al programa perl pel que fa al FT NF-AP1. Per aquest motiu, la posició del FT en la seqüència promotora no ens coincideix amb el resultat del PROMO.

FTs de la seqüència promotora del gen MDS1

Taula 22. Resultats del programa perl. Es mostren els FTs més significatius amb una S* elevada i un p-value inferior a 0,05.

Taula 23. Resultats del PROMO pels FTs identificats amb el nostre programa.

Taula 24. Resultats del PROMO. S'indica els FTs i el nombre d'aparicions de cada un. Per descartar FTs poc probables, només s'han considerat com significatius aquells que presentaven una dissimilaritat inferior a 5 i un RE equally inferior a 0,1.

         Per últim es va caracteritzar la regió promotora del gen MDS1. En aquest cas, es va observar que un dels FTs que ens indicava el programa perl, NF-Kappaβ, no apareixia en la llista de possibles FTs del PROMO. També vam obtenir un altre FT al programa perl, NF-AT-1. Aquest últim si que estava present a la llista del PROMO, però com hem comentat anteriorment, la matriu per aquest FT es diferent als dos programes utilitzats.

ESTUDI DE LA FUNCIÓ

El gen AML1 (RUNX1) codifica per la subunitat α del complex CBF. La subunitat CBFα té un domini runt d'unió al DNA i presenta activitat com a factor de transcripció (p53-like). El gen RUNX2, per altra banda, codifica per la subunitat CBFβ, que es manté retinguda al citoplasma per l'acció de la filamina A (proteïna del citoesquelet d'unió a l'actinina).

D'aquesta manera, quan hi ha absència de filamina A, la subunitat CBFβ es transloca al nucli i potencia l'acció d'AML1, augmentant la seva capacitat d'unió al DNA i protegint a AML1 de la degradació per ubiquitines. AML1 activarà l'expressió de diversos gens, entre els quals destaquem els implicats en la hematopoesi (GO:0030097), que estaran involucrats en la malaltia provocada per la proteïna de fusió.

Altres funcions de RUNX1:

• Desenvolupament multicel·lular de l'organisme (GO:0007275)
• Regulació positiva de la angiogènesi (GO:0045766)
• Regulació positiva de la diferenciació de granulòcits (GO:0030854)
• Regulació positiva de la transcripció a partir del promotor de la RNA pol II (GO:0045944)
• Regulació de la transcripció dependent de DNA (GO:0006355)

         El gen MDS1 codifica per un factor de transcripció, però la seva funció encara està per determinar. La seva importància ve donada pel fet que en la translocació, MDS1 queda situat entremig d'AML1 i EVI1 fent que acabi formant part de la proteïna de fusió.

         En referència al gen EVI1, en humans no s'ha determinat la funció que tindria a les cèl·lules, però s'ha comprovat que correspon a un lloc d'integració vírica ecotròpica. Tot i així s'ha vist que en Rattus norvegicus si que tindria diverses funcions com ara la regulació de la proliferació cel·lular i la regulació positiva de la transcripció a partir del promotor de la RNA pol II. Cal dir però, que aquestes funcions es basen en prediccions.

         Com ja hem dit abans, la proteïna de fusió (AME) dóna lloc a una malaltia anomenada leucèmia mieloide crònica. Aquesta proteïna actua com una oncoproteïna multi-funcional, ocasionant desordres a les cèl·lules hematopoètiques i provocant una transformació maligna en aquestes. S'han identificat 4 mecanismes on AME hi esta involucrada:

1. Exerceix un efecte dominat negatiu sobre AML1 wt. Quan CBFα forma el complex amb CBFβ, CBFα es torna un factor de transcripció actiu. Però la proteïna AME també és capaç d'interaccionar amb CBFβ i a més ho fa amb més afinitat que no pas AML1, competint així pels llocs d'unió a CBFβ. AME també es troba associat al repressor CtBP (C-terminal Binding Protein) que recluta HDAC (histone deacetylase). D'aquesta manera AME activa la repressió de la transcripció dels gens targets d'AML1.


2. Reprimeix la senyal TGFβ. TGFβ s'uneix al receptor serina-treonina quinasa tipus II. Aquest activarà el receptor tipus I que fosforilarà Smad3. Smad3 forma compleix amb Smad4 i es produeix una translocació al nucli. El complex actua com a factor de transcripció inhibint el creixement cel·lular. AME es capaç d'unir-se a Smad3 gràcies al seu primer domini zinc-finger (EVI1) provocant així una interferència en la activitat transcripcional de Smad3. Amb la inactivació de Smad3, es produeix una anormalitat en la inhibició del creixement.


3. Inhibeix l'activitat de JNK (c-Jun N-terminal Kinase). L'estrès, la llum UV, la radiació gamma o els shocks osmòtics entre d'altres provoquen la fosforilació de JNK, produint la seva activació. Quan JNK s'activa, es transloca al nucli fosforilant factors de transcripció com Jun, provocant la inducció de l'apoptosi. AME s'uneix a JNK de manera que aquesta última no es pot unir als seus substrats i es produeix una repressió de la inducció de l'apoptosi.


4. Estimula l'activitat AP-1. AME activa la transcripció de c-Fos que formarà un heterodimer amb Jun, això donarà lloc a un augment de l'activitat d'AP1 que promourà la proliferació cel·lular.

CONCLUSIONS

         La proteïna de fusió AME originada de la translocació t(3;21)(q26;q22) està formada pels tres primers exons d'AML1 (transcrits 2,4,5 o 6), l'exó tres de MDS1, exó dos i part del tres no codificants d'EVI1, i tots els exons codificants també d'EVI1 (transcrit 1). S'ha vist que algunes espècies presenten un gen d'homologia amb la proteïna AML1-EVI1, encara que aquesta proteïna sigui tïpica d'una translocació humana. Els tres gens es transcriuen de forma reversa de manera que al produïr-se la translocació permet que aquests gens es puguin transcriure un darrera l'altre formant la proteïna de fusió. Els gens MDS1 i EVI1 quedan sotmesos sota el control de la regió promotora d'AML1. En conseqüència, l'expressió de la proteïna de fusió queda restringida als teixits on AML1 s'expressa característicament. Com s'ha vist, els teixits on s'expressa AML1 de forma abundant són medul·la òssia, sang perifèrica i timus, ja que la funció principal d'AML1 és el desenvolupament de les cèl·lules hematopoètiques. Per tant, l'acció d'AME repercutirà sobre aquests teixits, donant lloc a anomalies de la sang, com la leucèmia mieloide crònica.

BIBLIOGRAFIA

1. Fears, S., Mathieu, C., Zeleznik-Le, N., Huang, S., Rowley, J.D., Nucifora, G. (1996) Intergenic splicing of MDS1 and EVI1 occurs in normal tissues as well as in myeloid leukemia and produces a new member of the PR domain family. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, p. 1642-1647.

2. Mitani, K. (2004) Molecular mechanisms of leukemogenesis by AML1/EVI1. Oncogene 23, p. 4263-4269.

3. Cuenco, G.M., Nucifora, G., Ren, R. (2000) Human AML1/MDS1/EVI1 fusion protein induces an acute myelogenous leukemia (AML) in mice: A model for human AML PNAS. 97, p. 1760-1765.

4. Mitani, k., Ogawa, S., Tanaka, t., Miyoshi, H., Kurokawa, M., Mano, H., Yazaki, Y., Ohki, M., Hirai, H. (1994) Generation of the AML 1- EVI- 1 fusion gene in the t(3;21)(q26;q22) causes blastic crisis in chronic myelocytic leukemia. The EMBO Journal. 13, p. 504-510.

5. Tanaka, t., Mitani, K., Kurokawa, M., Ogawa, S., Tanaka, K., Nishida, J., Yazaki, Y., Shibata, Y., Hirai, H. (1995) Dual Functions of the AML1/Evi-1 Chimeric Protein in the Mechanism of Leukemogenesis in t(3;21) Leukemias. Molecular and Cellular Biology. 15, p. 2383-2392.

6. Izutsu, K., Kurokawa, M., Imai, Y., Ichikawa, M., Asai, T., Maki, K., Mitani, K., Hirai, H. (2002) The t(3;21) fusion product, AML1/Evi-1 blocks AML1-induced transactivation by recruiting CtBP. Oncogene 21, p. 2695-2703.

7. Messeguer, X., Escudero, R., Farré, D., Nuñez, O., Martínez, J., Mar Albà, M. (2002) "PROMO: detection of known transcription regulatory elements using species-tailored searches". Bioinformatics 18, p. 333-334.

8. Farré, D., Roset, R., Huerta, M., Adsuara, J.E., Roselló, L., Mar Albà, M., Messeguer, X. (2003) "Identification of patterns in biological sequences at the ALGGEN server: PROMO and MALGEN". Nucleic Acids Res, 31, p. 3651-3653.

9.   www.ncbi.nlm.nih.gov

10. www.ensembl.org

11. www.genome.ucsc.edu

12. www.ebi.ac.uk/clustalw

13. www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit

14. www.megasoftware.net

15. www1.imim.es/courses/BioinformaticaUPF