Bos grunniens mutus

MATERIALS i MÈTODES

Discussió

Selenoproteïnes

Sel 15

En aquest cas hem utilitzat la query de la selenoproteïna 15 del genoma de Bos taurus. En realitzar el Blast hem obtingut 2 hits d’entre els quals hem seleccionat el hit contingut en l’scaffold JH880418.1 del mateix sentit que l’anotació (forward). Aquest hit prensenta un E–value de 6e –20.

En l’exonerate, el hit conté 4 exons i 3 introns, així com un raw score de 678. Pel que fa al T–coffee, en obtenir un score de 100 veiem com es tracta d’un alineament molt bo entre les dues proteïnes. Respecte la predicció d’elements SECIS n’hem obtingut només un, situat en la regió 3’ UTR en la posició 571 downstream.

Amb aquests resultats podem concloure que la selenoproteïna 15 està molt conservada en l’evolució, ja que la seva seqüència s’ha mantingut completament inalterada en el genoma de les dues espècies.

Sel H

La seqüència query utilitzada per a identificar la selenoproteïna H en el genoma de Bos grunniens mutus l’hem obtingut del genoma de Bos taurus. En realitzar el Blast, hem obtingut 1 hit, contingut en l’scaffold JH880685.1 amb un sentit diferent que el de l’anotació (reverse) que presenta un E–value de 7e –26.

En l’exonerate, aquest hit conté 2 exons i 1 intró, així com un raw score de 403. En quant al T–coffee, hem obtingut un score de 99, donat que la proteïna del genoma de Bos grunniens mutus difereix en un aminoàcid respecte la present en Bos taurus. Per altra banda, degut a que l’scaffold estava tallat, en l’alineament de la proteïna es pot observar una regió ––––––. Hem agafat tot l’scaffold, però tot i així no hem pogut alinear tota la proteïna. Sense tenir en compte la part inicial d’aquesta, l’alineament és molt bo. La predicció d’elements SECIS ha estat positiva, obtenint–ne un nombre de dos. Hem considerat que el primer corresponia a l’element SECIS de la nostra proteïna Sel H, ja que presenta l’score més elevat (32,69). Es troba situat en la regió 3’ UTR en la posició 19168 downstream.

Amb aquests resultats podem concloure que la selenoproteïna H es troba conservada en el genoma de les dues espècies, ja que malgrat la problemàtica de l’scaffold hem aconseguit alinear pràcticament tota la seqüència amb èxit, diferint tant sols en un aminoàcid. En aquest cas, la selenocisteïna es troba al principi de la seqüència de la proteïna.

Sel I

Respecte la selenoproteïna I, la seqüència query utilitzada l’hem obtingut del genoma de Bos taurus. En realitzar el Blast, hem obtingut 2 hits amb E–values suficientment petits, d’entre els 4 hits totals. El primer hit presenta un E–value de e –127, es troba contingut en l’scaffold JH881515.1 i segueix el sentit oposat de l’anotació (reverse). El segon hit, en canvi, presenta un E–value lleugerament menor (4e –35), es troba situat en l’scaffold JH881124.1 i segueix el mateix sentit de l’anotació (forward).

En l’exonerate, el primer hit conté 2 exons i presenta un raw score de 1386. El segon hit conté 10 exons i 9 introns, i presenta un raw score de 2028. Sorprenentment, malgrat que el primer hit presentava un E–value menor, no hem obtingut el millor alineament. Aquest presenta un score de 88. Sembla ser que no es tradueix a selenoproteïna, ja que malgrat que en el seu primer exó la seqüència sembli estar molt conservada, en el segon exó presenta algunes deleccions que fan que la proteïna no sembli funcional. En el segon hit, en canvi, hem obtingut un molt bon alineament, el qual presenta un score de 100. Pel que fa a la predicció d’elements SECIS aquesta ha estat positiva per ambdós hits. Malgrat que el primer hit, com ja hem vist, no es traduiria a selenoproteïna, hem obtingut un element SECIS just al final de la seqüència, on esperem que aquest es trobi. En el cas del segon hit, aquest també presenta dos elements SECIS. El primer SECIS, el qual comença a la posició 1247, correspondria al de la proteïna, ja que és el que presenta un SCORE major (25,8).

Aquests resultats ens porten a afirmar que la proteïna Sel H, continguda en l’scaffold JH881124.1, està conservada entre les dues espècies. En quant al primer hit, contingut a l’scaffold JH881515.1, probablement es tracti d’un pseudogen, ja que com hem vist no sembla ser funcional.

Sel K_151

En realitzar el Blast, només hem obtingut 1 hit amb un valor d’E–value suficientment petit com per tenir–lo en compte. Aquest hit es troba contingut en l’scaffold JH883154.1 amb el sentit contrari al de l’anotació (reverse) i el qual presenta un E–value de 2e –23.

En un inici, no hem pogut realitzar l’exonerate degut a que la proteïna Sel K (151) no es troba ben anotada en selenoDB (conté un símbol @ en la seqüència). Tot i així, hem eliminat el símbol i hem seguit amb el procés. Hem obtingut un sol exó i un valor de raw score de 372. Ens ha sorprès haver obtingut en el lloc on hi havia el símbol @, un codó TGA, que podria correspondre a una selenocisteïna (U). Així, és possible que s’hagi produït un error en l’anotació de la proteïna a selenoDB. En realitzar el T–coffee, per aquest únic hit analitzat hem obtingut un score molt baix, de 91. Per una banda, el codó TGA que havia aparegut al centre de la seqüència ha desaparegut. Per l’altra banda, l’alineament obtingut no és gens bo, sobretot al final de la seqüència de la proteïna, on comença a degenerar molt.

Malgrat que els resultats obtinguts en l’alineament indiquin que possiblement no es tracti d’una selenorpoteïna funcional, hem buscat els elements SECIS i, com ja ens temíem, no n’hem obtingut cap.

Les conclusions a les quals arribem amb els resultats obtinguts en alinear la proteïna Sel K (151) amb el genoma de Bos taurus és que no es tracta d’una selenoproteïna i que no s’ha mantingut evolutivament com a tal en la nostra espècie, Bos grunniens mutus.

Sel K_152

En realitzar el Blast, hem obtingut 2 hits amb valors de E–value suficientment petits. El primer hit, contingut en l’scaffold JH883154.1 amb un sentit diferent que el de l’anotació (reverse) presenta un E–value de 8e –14. El segon hit, per contra, està contingut en l’scaffold JH881195.1 amb el mateix sentit que l’anotació (forward) i presenta un E–value de 1e –12.

En l’exonerate, el primer hit conté un sol exó i un raw score molt baix, de 276. En realitzar el fasta seq i el fasta subseq d’aquest primer hit, hem obtingut una seqüència en el genoma de Bos grunniens mutus que conté 4 codons TGA (stop). El segon hit conté 4 exons i 3 introns, així com un raw score una mica més elevat (482). Pel que fa al T–coffee, en el cas del primer hit hem obtingut un score de 98 tot i que l’alineament no és massa bo. Hem considerat que la proteïna pot no ser funcional, ja que conté 4 codons Stop en la seva seqüència i podria estar truncada. Per tant, aquest primer hit no correspondria a la proteïna Sel K (152) de Bos Taurus. En el cas del segon hit, en canvi, en alinear–lo amb el genoma, hem obtingut un alineament complet i perfecte cosa que ens indica que aquest sí que correspon a la proteïna Sel K (152).

En la predicció d’elements SECIS, en el primer hit no n’hem obtingut cap. Per contra i, com era d’esperar, sí que n’hem obtingut en el segon hit; un nombre de dos. El primer hem considerat que correspon a l’element SECIS de la nostra proteïna Sel K (152), ja que presenta l’score més elevat (23,36). Es troba situat en la regió 3’ UTR en la posició 2587 downstream.

Amb aquests resultats podem concloure que la selenoproteïna Sel K (152) de Bos taurus s’ha mantingut evolutivament en les dues espècies. Aquesta es troba continguda en l’scaffold JH881195.1 del genoma de Bos grunniens mutus. En aquest cas, la seqüència de la proteïna és molt curta i la selenocisteïna es troba al final de la seqüència.

Sel M

Per tal d’estudiar si la Sel M està conservada en la nostra espècie hem utilitzat la seqüència query de Bos taurus. Mitjançant el Blast, hem obtingut dos hits. Ens hem centrat en l’obtingut a l’scaffold JH883225.1 ja que té un E–value més òptim (1e–25). El hit es troba en el mateix sentit que l’anotació (+).

La proteïna escollida descrita per l’exonerate té un total de 5 exons, 4 introns i un raw score de 692. Pel que fa a l’alineament obtingut després de fer el T– coffee, és perfecte excepte en un aminoàcid, i inclou la selenocisteïna. Presenta un score de 100 i una llargada de 142 aa (des del nucleòtid 49939 al 52429). Mitjançant el programa Seblastian veiem que hi ha un element SECIS a l’extrem 3’UTR que comença a la posició 85 downstream.

Basant–nos en els resultats obtinguts a partir del T– coffee i el Seblastian podem concloure que la selenoproteïna Sel M està molt conservada en l’evolució; la seva seqüència es troba intacta en el genoma de dues espècies diferents i la selenocisteïna es situa en la mateixa posició.

Sel N

En aquest cas, com la majoria de vegades, hem utilitzat com a seqüència query la Sel N de Bos taurus degut a la proximitat filogenètica amb la nostra espècie. En fer el Blast, només hem obtingut un hit. Aquest té un E–value de 1e–37 i es troba a l’scaffold JH881135.1, en el mateix sentit que l’anotació (+). El programa exonerate ens indica que es tracta d’una proteïna amb 10 introns, 11 exons i un raw score de 2563.

En realitzar el T– coffee hem obtingut un alineament perfecte entre els dues seqüències amb un score de 100 i una llargada de 498 aminoàcids. Amb Seblastian hem obtingut dos elements SECIS: un amb un score de 40,73 i un altre amb un score de 10,8. Ambdós es troben a l’extrem 3’UTR. El primer comença a la posició 1102 downstream mentre que el segon comença a la 12409.

Aquests resultats ens permeten afirmar que la Sel N es troba molt conservada evolutivament, ja que l’alineament de les dues seqüències en espècies diferents és perfecte i contenen la selenocisteïna en la mateixa posició.

Sel R

La seqüència query amb la que hem comparat la nostra seqüència d’interès pertany a l’espècie Bos taurus. Hem obtingut 3 hits en fer el Blast. D’aquests ens hem centrat en el que pertany a l’scaffold JH880269.1, que té un E–value de 7e–28. Aquest es troba en el mateix sentit que l’anotació (+).

El programa exonerate ens prediu una proteïna de 3 exons i 2 introns i ens dóna un valor de raw score de 608. Hem fet el T– coffee i hem aconseguit un alineament perfecte entre la seqüència query i la de la nostra espècie d’interès. L’score és de 100 i la llargada de 112 aminoàcids.

En utilitzar el programa Seblastian per comprovar si hi ha elements SECIS, obtenim que efectivament n’hi ha un, situat com tots a l’extrem 3’ UTR i amb inici a la posició 1743 downstream. Després de fer el T– coffee i el Seblastian podem concloure que la selenoproteïna Sel R està ben conservada evolutivament, ja que la seva seqüència es presenta inalterada en les dues espècies comparades i la selenocisteïna es troba a la mateixa posició.

Sel O

La seqüència query utilitzada per a identificar la selenoproteïna O en el genoma de Bos grunniens mutus l’hem obtingut del genoma de Bos taurus. S’han descrit quatre variants de la proteïna però només una d’elles correspon a una selenoproteïna. Per aquest motiu només analitzarem aquesta variant. En realitzar el BLAST, hem obtingut 4 hits però només un d’ells presenta un E–value suficientment petit per a ser seleccionat per analitzar. Aquest hit es troba contingut en l’scaffold JH882190.1 amb el mateix sentit que l’anotació (forward) i un E–value de 4e –58.

En el pas de realitzar l’exonerate ens hem adonat que la proteïna ha perdut una part de la seqüència, corresponent a la seva part final, on trobem la selenocisteïna (U). Degut a que l’exonerate no s’ha realitzat del tot correctament, només hem pogut determinar el raw score (2167). En realitzar l’alineament entre els dos genomes, hem obtingut un Score de 99. Veiem com la proteïna alinea pràcticament per complet, però com ja hem dit abans, la part final on hi ha continguda la selenocisteïna, no hi és. En realitzar la búsqueda d’elements SECIS, el resultat ha estat negatiu, ja que no n’hem obtingut cap.

Els resultats obtinguts ens porten a pensar que la selenoproteïna O no s’ha mantingut en l’evolució i, per tant, no la trobem en el genoma de Bos grunniens mutus. La seqüència que ha alineat pot ser que correspongui a una part de la proteïna, però com hem vist, aquesta no s’ha mantingut com a selenoproteïna, ja que ha perdut tant la selenocisteïna com els elements SECIS.

Sel P

Hem escollit la seqüència query de Bos taurus per proximitat evolutiva amb la nostra espècie. Després de dur a terme el Blast, hem trobat 3 hits, però només 1 d’ells tenia un valor d’E–value amb exponent inferior a –10 (E–value = 4e–72). Aquest hit pertany a l’scaffold JH881047.1, i es troba en el mateix sentit que l’anotació (+).

Al dur a terme l’exonerate obtenim que la proteïna predita té 5 exons i 4 introns, i un raw score de 1100. En aquest cas, hem observat que la seqüència de la Sel P de Bos taurus conté moltes U, concretament 12. Això ens podria fer sospitar que pot estar mal anotada i que les U corresponen a aminoàcids no identificats enlloc de selenoproteïnes. Tot i així, l’alineament obtingut després de fer el T– coffee és força bo (té un score de 98) i veiem que les U de la seqüència query s’alineen amb les de la nostra espècie. Per tant, podem dir que la seqüència no està mal anotada sinó que conté moltes selenocisteïnes. L’alineament té 409 aminoàcids de llargada.

El Seblastian ens dóna com a resultat la presència de dos elements SECIS a la regió 3’ UTR: el primer amb un score 32,5 i el segon amb un score de 27,63. El primer comença a la posició 240 downstream i el segon a la 641. Les selenocisteïnes es troben a la mateixa posició en les seqüències de les dues espècies, i la gran majoria d’aminoàcids coincideixen. Tanmateix, a la meitat de l’alineament hi ha un tros de seqüència que no pot ser alineada correctament. Tot i així, donat que la resta de l’alineament és quasi perfecte i la puntuació del T– coffee és alta, podem concloure que la Sel P és una selenoproteïna conservada evolutivament.

Sel S

La seqüència amb la que hem buscat fer l’alineament de la selenoproteïna d’interès pertany a l’espècie Bos taurus. Amb el Blast hem obtingut 3 hits. El primer, corresponent a l’scaffold JH881576.1 té un E–value de 2e–21, i el segon, corresponent a l’scaffold JH881502 el té de 4e–6. El tercer hit presenta un E–value massa elevat i ja no l’hem considerat. Tot i que l’E–value corresponent al segon hit està elevat a e–6, l’hem considerat i hem provat d’alinear la nostra seqüència. L’alineament no ha estat gens òptim i per tant, desestimem aquest segon hit i ens quedem amb el primer. Es troba en sentit contrari a l’anotació (–).

La proteïna que descriu l’exonerate té un raw score de 941 i presenta 5 introns i 6 exons. Amb l’scaffold JH881576.1 l’alineament obtingut és perfecte, té un score de 100 i una llargada de 190 aminoàcids. En canvi, l’alineament amb l’scaffold JH881502.1 no és òptim: la selenocisteïna no s’alinea correctament i hi ha pocs aminoàcids que coincideixen entre les seqüències de les dues proteïnes. Donat que ja havíem obtingut un molt bon alineament amb el hit anterior, simplement desestimem aquest alineament.

Pel que fa als elements SECIS, el programa Seblastian ens dóna com a resultat la presència de dues d’aquestes estructures ubicades a l’extrem 3’UTR: una amb un score de 26,75 que té inici a la posició 19536 downstream, i un altra amb un score de 10,56 que té inici a la posició 6276 downstream. A partir de l’alineament fet en el primer hit, i després d’haver analitzat els elements SECIS, podem afirmar que la selenoproteïna Sel S està conservada evolutivament. La selenocisteïna es troba en la mateixa posició dins la seqüència del genoma de les dues espècies, i tots els aminoàcids de la proteïna estan perfectament alineats.

Sel T

Hem buscat alinear la nostra seqüència d’interès amb la corresponent seqüència de l’espècie Bos taurus.

L’anàlisi amb Blast ens ha donat 2 hits. L’únic que tenia un E–value òptim és el corresponent a l’scaffold JH882363.1 (E–value= 4e–20) i es troba en sentit contrari a l’anotació (–). La proteïna descrita per l’exonerate té un raw score de 959 i presenta 5 exons i 4 introns. El T– coffee ens indica que l’alineament té una llargada de 190 aminoàcids i un score de 100.

Finalment, hem observat que hi ha un element SECI mitjançant Seblastian. Aquest es troba a la regió 3’ UTR i té el seu inici a la posició 19318 downstream. Considerant l’alineament perfecte que hem obtingut amb el T– coffee i l’element SECIS trobat, podem concloure que aquesta selenoproteïna es troba ben conservada evolutivament; la seva seqüència roman intacta als genomes de les espècies Bos taurus i Bos grunniens mutus, incloent la selenocisteïna.

Sel V

La seqüència query d’aquesta selenoproteïna s’ha extret del genoma d’Homo sapiens. El resultat del BLAST era de 3 hits, cap dels quals tenia un E–value inferior a e–10. Tot i així es va seleccionar el hit amb l’E–value més favorable (5e–8), el qual l’alineament incloïa la selenocisteïna. Estava situat a l’scaffold JH882736.1. Després d’executar l’exonerate i el T–coffee no s’ha obtingut cap alineament. No s’ha detectat el problema. Per aquest motiu s’han analitzat la resta de hits però cap alineava la selenocisteïna, per aquest motiu no es va prosseguir amb l’anàlisi d’aquests.

Sel W_171

La seqüència query pertany a l’espècie Bos taurus i ens interessa per la proximitat evolutiva amb la nostra espècie. Després de realitzar el Blast obtenim un total de 4 hits. Els 3 primers, que pertanyen als números d’scaffold JH882736.1, JH881019.1 i JH881705.1 contenen E–values bons (9e–12, 4e–20 i 8e–11 respectivament) i tots es troben en sentit contrari a l’anotació (–). De totes maneres, només s’obté un bon alineament amb el hit corresponent a l’scaffold JH882736.1.

La proteïna descrita per l’exonerate està formada per tan sols un sol exó, i té un raw score de 386. Després de realitzar el T– coffee obtenim un alineament molt bo, d’score 100 i llargada de 78 aminoàcids. Pel que fa als elements SECIS, obtenim que n’hi ha un a la regió 3’UTR que comença a la posició 19872 downstream.

L’alineament òptim aconseguit amb el T– coffee i el resultat que ens ha donat el Seblastian ens porta a concloure que la selenoproteïna W171 està ben conservada evolutivament; la seva seqüència és pràcticament la mateixa en el genoma de les dues espècies comparades i la selenocisteïna es troba en la mateixa posició. De la família de selenoproteïnes Sel W, la W171 és l’única que està conservada evolutivament; com es descriu al seu apartat corresponent, en la Sel W174 s’obté un alineament força bo just en el mateix hit on s’obté l’alineament de la Sel W171. Això, tanmateix, és degut simplement a que, com que es dues proteïnes pertanyen a la mateixa família, són molt semblants. Així doncs, donat que hem obtingut un millor alineament de la W171 al hit en qüestió, corresponent a l’scaffold JH882736.1, descartem l’alineament de la W174.

Sel W_173

La seqüència escollida pertany a l’espècie Bos taurus. A partir del Blast obtenim un total de 2 hits, però només el primer, corresponent al número d’scaffold JH880627.1 té un valor d’E–value rellevant (1e–63). Aquest es troba en el mateix sentit que l’anotació (+).

En fer l’exonerate, veiem que el raw score és de 1052 i que proteïna descrita té 11 exons. Observant les posicions on s’inicien i acaben els exons, sospitem que aquesta proteïna pot tenir splicings alternatius, perquè la majoria dels exons tenen origen en posicions molt juntes del genoma i acaben també quasi a la mateixa posició.

En aquest cas, amb el T– coffee obtenim un mal alineament de 1455 aminoàcids de llargada; l’score és de 87, però la selenocisteïna no es troba alineada entre les seqüències de les dues espècies. A més, les dues seqüències només es troben alineades en una petita regió, i això es deu probablement a que la Sel W173 pertany a la mateixa família que la Sel W171, que sí que es troba conservada, i s’hi assembla força. La selenoproteïna W173 no presenta elements SECIS a l’extrem 3’ UTR.

Sel W_174

Hem triat una seqüència de Bos taurus com a query per buscar l’alineament amb la nostra seqüència. En fer el Blast, observem que els hits obtinguts són exactament els mateixos que en el cas de la Sel W171, i els 3 es troben també en sentit contrari a l’anotació (–). A més, es troben en el mateix ordre, és a dir, el hit més òptim (amb E–value més baix) és el mateix en els dos casos.

De totes maneres, els valors de E–value obtinguts varien lleugerament. Pel hit corresponent a l’scaffold JH882736.1 l’E–value obtingut és de 5e–21, per l’scaffold JH881019.1 l’E–value és de 6e–15 i pel corresponent a JH881705.1 és 4e–9. Vam decidir provar l’alineament en els 3 hits: sospitàvem que, encara que fos el millor, el primer E–value no seria amb el que obtindríem el millor alineament en aquest cas (donat que ja l’haviem obtingut en la Sel W171). Pensàvem que l’alineament més òptim en el cas de la W174 es trobaria en el segon hit, però vam començar igualment pel primer.

La proteïna descrita per l’exonerate té un raw score de 356 i està formada només per 1 exó però cap intró. Al fer el T– coffee obtenim un alineament força bo, de 87 aminoàcids de llargada i una score de 99. De totes maneres, quan vam procedir a provar d’alinear la seqüència de la nostra espècie amb els altres dos scaffolds, els alineaments que vam obtenir no van ser gens bons i els vam descartar. Per tant, ens vam trobar davant la situació que tant la W171 com la W174 es podien alinear força bé amb el mateix scaffold. Ara bé, l’alineament obtingut en la W171 era millor, fet que ens ha portat a descartar el de la W174 i a concloure que aquesta última selenoproteïna no està conservada evolutivament; el bon alineament obtingut es deu simplement a que és molt semblant a la W171 perquè pertanyen a la mateixa família, i aquesta última és la que sí que està conservada evolutivament. En aquest cas el programa Seblastian no ha donat elements SECIS.

Família Gpx

S’ha intentat identificar a l’espècie Bos grunniens mutus totes les selenoproteïnes de la família de Gpx (Glutation peroxidase proteins) descrites en mamífers, utilitzant com a query les de l’espècie de referència Bos taurus, ja que evolutivament és la més propera i, per tant, s’espera que aquestes estiguin conservades. L’estratègia que s’ha seguit per poder identificar–les totes ha estat, en primer lloc, realitzar un Blast per cadascuna de les selenoproteïnes descrites en Bos taurus, ja que degut a l’elevat grau d’homologia entre totes elles, molts hits són compartits. D’aquesta manera, s’han identificat els scaffolds repetits i no s’han tingut en compte. A més, com ja s’ha descrit en l’apartat de materials i mètodes s’han descartat aquells hits amb un E–value superior a e–10. De tota la resta, en el cas d’haver–hi més d’un hit, s’ha seleccionat per analitzar aquell amb un E–value inferior a e–10.

Gpx1

El resultat del BLAST d’aquesta proteïna ha estat de 15 hits. Després del cribatge mencionat s’ha seleccionat el hit amb un E–value de 3e–74, situat a l’scaffold JH883489.1 i contingut en la cadena negativa (reverse). Després d’executar el programa exonerate s’ha identificat el gen candidat amb un Raw score de 1011. Aquest conté 2 exons i 1 intró i es troba entre les posicions 135693 i 134841.

La proteïna predita en l’espècie Bos grunniens mutus té 197 aminoàcids igual que la query, i la selenocisteïna es troba en la posició 45, (coincideix amb la de referència). Tan sols s’han trobat 3 aminoàcids que difereixen respecte a la query utilitzada, i es troben a l’inici de la proteïna.

Després d’analitzar l’alineament amb T–coffee, s’ha pogut confirmar que aquesta selenoproteïna està conservada. Pràcticament el 100% d’aminoàcids concorden amb la proteïna de referència. A més, presenta l’element SECIS al final de la seqüència.

Gpx2

El resultat del Blast d’aquesta proteïna ha estat de 15 hits. Després de descartar aquells hits sota els criteris comentats anteriorment, s’ha seleccionat el hit amb l’E–value de 2e–74. Aquest es troba contingut en l’scaffold JH883665.1 en la cadena negativa (reverse). Després d’executar el programa exonerate s’ha identificat el gen candidat entre el nucleòtid 64923 i 61790. Aquest està format per 2 exons i 1 intró. El raw score és de 1008.

La proteïna predita en l’espècie Bos grunniens mutus té 190 aminoàcids igual que la query, i la selenocisteïna es troba en la posició 40, coincidint també amb la de referència.

Després de realitzar l’alineament amb T–coffee, s’ha determinat la presència d’aquesta selenoproteïna en el genoma de Bos grunniens mutus, essent perfectament conservada. S’ha identificat element SECIS al final de la seqüència de la proteïna.

Gpx3

El resultat del Blast d’aquesta proteïna ha estat de 15 hits. S’ha seleccionat aquell hit amb un E–value de 3e–39 situat en l’scaffold JH881283.1, en la cadena negativa (reverse). Després d’executar el programa exonerate s’ha identificat el gen candidat entre el nucleòtid 63529 i 60878, format per 4 exons i 3 introns. El raw score obtingut ha estat de 1006.

La proteïna predita en l’espècie Bos grunniens mutus tenia 197 aminoàcids (igual que la query). A més, la selenocisteïna es troba en la posició 46, coincidint també amb la de referència.

Després d’analitzar l’alineament realitzat amb T–coffee, s’ha determinat la presència d’aquesta selenoproteïna en el genoma i per tant, aquesta es troba perfectament conservada (100% coincidència). Finalment, s’ha identificat un element SECIS al final de la seqüència proteica.

Gpx4

El resultat del Blast d’aquesta proteïna ha estat de 12 hits. S’ha seleccionat el hit amb un E–value de 2e–49, situat en l’scaffold JH880617.1 de la cadena negativa (reverse). Després d’executar el programa exonerate s’ha identificat el gen candidat, format per 3 exons i 2 introns entre els nucleòtids 67522 i 66948. El raw score d’aquest hit ha estat de 568.

La proteïna predita en l’espècie Bos grunniens mutus té 108 aminoàcids (igual que la query) i la selenocisteïna es troba en la posició 14, coincidint amb la selenoproteïna de referència.

Després d’analitzar l’alineament amb T–coffee, s’ha pogut predir la presència de la selenoproteïna en el genoma, la qual es troba perfectament conservada. Aquesta proteïna presenta l’element SECIS al final de la seqüència.

Gpx5

El resultat del Blast d’aquesta proteïna ha estat de 16 hits. En aquest cas, s’han seleccionat dos hits bons. D’aquesta manera s’ha realitzat l’anàlisi de tots dos. El primer presenta un E–value inferior (2e–40) i es troba situat a l’scaffold JH882396.1 en la cadena negativa (reverse). Està format per 3 exons i 2 introns. La proteïna codificada per aquest hit està tallada, i li falta tota la seqüència del principi. Aquest fet pot ser degut a la indexació, la qual ha fet que l’scaffold hagi dividit la proteïna per la meitat. Per tal de corroborar–ho s’ha prosseguit a analitzar el segon hit. Aquest presenta un E–value de 3e–26 i es troba contingut en l’scaffold JH889420.1 i en la cadena negativa (reverse). Consta de 3 exons i 2 introns.

Després d’executar el programa exonerate s’ha identificat el gen candidat a ser selenoproteïna, contingut entre el nucleòtid 1857 fins el final de l’scaffold JH9420.1 i el principi de l’scaffold JH882396.1 fins al nucleòtid 1902. La proteïna predita en l’espècie Bos grunniens mutus té 219 aminoàcids, tot i que presenta un gap al mig de la seqüència de 19 aminoàcids que no s’alineen amb el genoma (possiblement degut a que els extrems dels scaffolds no estan seqüenciat amb fidelitat) i, per tant, hi ha pèrdua d’informació genòmica. Aquesta proteïna no conté selenocisteïna tal i com passava amb la GPx5 de Bos taurus i d’Homo sapiens.

Després d’analitzar l’alineament amb T–coffee, s’ha pogut afirmar que possiblement aquesta proteïna es troba conservada en l’espècie Bos grunniens mutus. Però donat que la seqüència genòmica està partida en dos scaffolds diferents, no ho podem afirmar amb seguretat. Aquesta proteïna no presenta selenocisteïnes en la seva seqüència, però tampoc les presenta en el genoma de Bos taurus. No s’han identificat elements SECIS al final de la seqüència de la proteïna.

Gpx6

El resultat del Blast d’aquesta proteïna ha estat de 14 hits. S’ha seleccionat el hit d’un E–value de 3e–40 situat a l’scaffold JH882448.1 en la cadena negativa (reverse). Després d’executar el programa exonerate s’ha identificat el gen candidat, format per 5 exons i 4 introns entre els nucleòtids 607755 i 53695. El Raw score ha estat de 1165.

La proteïna predita en l’espècie Bos grunniens mutus té 221 aminoàcids (igual que la query) i la selenocisteïna es troba en la posició 73, coincidint amb la referència.

Després d’analitzar l’alineament amb T–coffee, s’ha pogut afirmar que aquesta selenoproteïna està perfectament conservada, ja que concorden el 100% d’aminoàcids amb la Gpx6 descrita en Bos taurus. A més aquesta proteïna presenta l’element SECIS al final de la seva seqüència.

Gpx7

El resultat del Blast d’aquesta proteïna ha estat de 14 hits. S’ha seleccionat el hit amb un E–value de 7e–60 situat a l’scaffold JH881035.1 de la cadena positiva (forward). Després d’executar el programa exonerate s’ha identificat el gen candidat, format per 2 exons i 1 intró, entre els nucleòtids 84272 i 86428. El Raw score ha estat de 668.

La proteïna predita en l’espècie Bos grunniens mutus té 135 aminoàcids (igual que la query) i no presenta selenocisteïnes en la seva seqüència proteïca (igual que en la proteïna de referència).

Després d’analitzar l’alineament amb T–coffee, s’ha determinat com aquesta proteïna està conservada. No el 100% d’aminoàcids concorden amb la GPx7 descrita en Bos grunniens mutus però tot i així, el grau d’homologia és molt elevat.

Gpx8

El resultat del BLAST d’aquesta proteïna ha estat de 13 hits. S’ha seleccionat el hit amb un E–value de 5e–52 situat a l’scaffold JH880333.1 de la cadena positiva (forward). Després d’executar el programa exonerate s’ha identificat el gen candidat el qual està format per 2 exons i 1 intró entre els nucleòtids 18723 i 22223. El Raw score ha estat de 540.

La proteïna predita en l’espècie Bos grunniens mutus té 123 aminoàcids (igual que la query) i no presenta selenocisteïnes a la seva seqüència proteica (no és selenoproteïna igual que la proteïna de referència).

Després d’analitzar l’alineament amb T–coffee, s’ha pogut afirmar com aquesta proteïna està conservada. Encara que no concordin el 100% d’aminoàcids amb la GPx8 descrita en Bos taurus, el grau d’homologia és molt elevat. No s’han identificat elements SECIS al final de la seqüència.

Gpx none

Es tracta d’una proteïna també de la família de les Gpx, tot i que en aquest cas a la base de dades Selenodb no té assignada una subfamília com és el cas de la resta de proteïnes d’aquest grup. Tot i que en mamífers tan sols hi hagi descrites 8 GPx, s’ha decidit analitzar si aquesta es troba en el genoma de l’espècie Bos grunniens mutus ja que està present en el genoma de l’espècie Bos taurus, molt propera evolutivament.

El resultat del Blast d’aquesta proteïna ha estat d’11 hits. S’ha seleccionat el hit amb un E–value de 2e–54 situat a l’scaffold JH881616.1 en la cadena positiva (forward). Després d’executar el programa exonerate s’ha identificat el gen candidat, format per 1 únic exó, entre els nucleòtids 53030 i 53297. El Raw score ha estat de 484.

La proteïna predita en l’espècie Bos grunniens mutus té 89 aminoàcids (igual que la query) i no presenta selenocisteïnes a la seva seqüència proteica, per tant, no és selenoproteïna.

Després d’analitzar l’alineament amb T–coffee, s’ha determinat que aquesta proteïna està conservada. El grau d’homologia respecte la mateixa proteïna de Bos taurus és molt elevat, únicament observem discordança en un aminoàcid. No s’ha trobat element SECIS al final de la seqüència proteica.

Família DI

DI1

El Blast per a aquesta proteïna ens ha donat 4 hits, el que hem escollit per a l’estudi és el que correspon a l’scaffold JH882123.1 ja que té un E–value millor (9e–71). El hit es troba en sentit contrari a l’anotació (–) i a través de l’anàlisi amb exonerate hem vist que té 4 exons i 3 introns.

L’alineamnet obtingut amb T-coffe és molt bo, l’score és de 100 i inclou la selenocisteïna. La llargada total és de 249 aminoàcids i la selenocisteïna es troba a la posició 126. Un cop hem confirmat que contenia l’aminoàcid que ens confirma que es una selenoproteïna hem buscat els elements SECIS. El progrma Seblastian ens ha mostrat que DI1 inclou un element SECIS situal a la posició 19075 downstream, l’Score de la busca és 33.75.

Per tant, els resultats demostren que DI1 és una proteïna molt conservada entre Bos Taurus i Bos grunniens mutus . D’una banda hem pogut trobar la selenocisteïna i l’alineament és molt bo, i de l’altra hem comfirmat la presència d’elements SECIS.

DI2

Mitjançant el Blast, hem obtingut com en el cas anterior 4 hits. Ens hem centrat en l’obtingut a l’scaffold JH882943.1 ja que té un E–value millor (1e–125). Es troba en sentit contrari a l’anotació (–).

La proteïna escollida descrita per l’exonerate té un total de 2 exons i 1 intro, l’alineament amb el T–coffee ha sigut molt satisfactori. La proteïna té un alt grau d’homologia amb la seqüencia de referència. Podem localitzar la selenocisteïna dins la seqüència, concretament es troba a la posició 133 d’un total de 265 aminoàcids alineats. L’score és de 100.

En la recerca dels elements SECIS hem vist que n’hi ha un situat a la posició 14714 downstream, l’score del qual és 24.43. La conslusió és doncs que DI2 és una proteïna altament conservada, trobant–se intacte entre els dos genomes comparats.

DI3

Per últim hem estudiat la proteïna DI3, en aquest cas només hem obtingut tres hits. El que hem escollit és el que té un major E–value, concretament de 1e–150. Es troba en sentit contrari a l’anotació (–) en l’scaffold JH881100.1. L’exonerate ha revelat que la proteïna inclou 2 exons i 1 intro, és relativament curta.

Pel que fa a l’alineament obtingut després de fer el T–coffee, és perfecte excepte en un aminoàcid, i inclou la selenocisteïna. Presenta un score de 100 i una llargada de 254 aa. La selenocisteïna es troba a la posició 127.

Mitjançant el programa Seblastian veiem que hi ha un element SECIS a l’extrem 3’UTR que comença a la posició 19296 downstream. l’Score del SECIS és de 20.24. Per tant el fet de que la proteïna contingui un element SECIS i de que l’alineament sigui tant bo ens fan pensar que es tracta d’un enzim molt conservat. Concloem doncs que DI3 és una proteïna que s’ha mantingut intacte en l’evolució entre Bos Taurus i Bos grunniens mutus .

Família SPS

SPS_145

Per examinar si la selenoproteïna SPS (145) de Bos grunniens mutus es troba conservada en l’evolució, hem fet servir la seqüència query de Bos taurus. Quan hem realitzat el Blast, hem observat 500 hits i ens hem centrat en l’scaffold JH880569.1 ja que és el que té un millor E–value (0.0). Aquest hit es troba en el mateix sentit que l’anotació.

Un cop fet l’exonerate, hem pogut observar que aquesta selenoproteïna està formada per 21 exons i 2 introns. Hem deduït que aquest fet és degut al Splicing alternatiu. Hem trobat que la SPS (145) té un raw score de 410. El T–coffee ens aporta l’alineament entre les dues selenoproteïnes. Aquest és molt dolent, ja que molts pocs aminoàcids s’alineen i la gran majoria no.

Mitjan�ant el programa Seblastian, hem pogut veure que aquesta selenoproteïna no conté elements SECIS en la seva seqüència. Per tant, observant l’alineament i l’absència d’elements SECIS en aquesta proteïna, hem pogut concloure que no es troba conservada en l’evolució.

SPS_148

Per determinar si la selenoproteïna SPS (148) de Bos grunniens mutus es troba conservada en l’evolució, hem fet servir la seqüència query de Bos taurus. Al realitzar el Blast, hem observat un únic hit, l’scaffold JH881322.1, el qual té un E–value de 6e–4. Tot i ser un E–value molt petit, hem decidit analitzar–lo igualment ja que és l’únic scaffold de la proteïna. Aquest hit es troba en el mateix sentit que l’anotació.

Amb l’exonerate, hem pogut observar que aquesta selenoproteïna està formada per 4 exons i 3 introns. Té un raw score de 1102. Un cop finalitzat el T–coffee, obtenim l’alineament entre les dues selenoproteïnes. A la primera part de l’alineament s’observa que els nucleòtids estan bastant conservats, però a la segona part de l’alineament, la seqüència es troba molt poc conservada.

A través del programa Seblastian, hem pogut veure que aquesta selenoproteïna no conté elements SECIS en la seva seqüència. Per tant, hem pogut concloure que la selenoproteïna SPS (148) es troba molt poc conservada en l’evolució.

SPS_2

Per comprovar si la selenoproteïna SPS2 de Bos grunniens mutus es troba conservada, hem utilitzat la seqüència query de Homo sapiens, degut a que aquesta proteïna no es trobava present al genoma de Bos taurus. Un cop fet el Blast, hem observat cinc hits, però ens hem centrat en aquell que tingués un E–value menor. En aquest cas, l’scaffold JH884122.1 que tenia un E–value de 5e–93. El hit es troba en el mateix sentit que l’anotació.

L’exonerate ens ha permès veure el nombre d’introns i d’exons d’aquesta selenoproteïna. SPS2 consta de dos introns i dos exons i té un raw score de 951. Després de realitzar el T–coffee hem obtingut l’alineament. Aquest és molt dolent i cap de les dues selenocisteïnes de la seqüència es troben alineades. Aquest fet segurament és degut a la llunyania filogenètica entre ambdues espècies. Aquest alineament presenta un score de 85 i una llargada de 520 aminoàcids.

Mitjançant el programa Seblastian, es pot veure la presència o absència d’elements SECIS. En aquest cas, no hi ha cap element SECIS en la seqüència. Tenint en compte l’alineament obtingut i l’absència d’elements SECIS en aquesta selenoproteïna, podem concloure que SPS2 no està conservada en l’evolució. Aquests resultats són els que esperàvem, degut a l’absència d’aquesta proteïna al genoma de Bos taurus, més proper filogenèticament a Bos grunniens mutus.

Família TR

TR1

Per examinar si la selenoproteïna TR1, de Bos grunniens mutus, es troba conservada en l’evolució, hem fet servir la seqüència query de Homo sapiens. Quan hem realitzat el Blast, hem observat 12 hits i ens hem centrat en l’scaffold JH883751.1 ja que és el que té un millor E–value (6e–44). Aquest hit es troba en el mateix sentit que l’anotació.

Un cop fet l’exonerate, hem pogut observar que aquesta selenoproteïna està formada per 2 exons i 2 introns. Té un raw score de 411. El T–coffee ens aporta l’alineament entre les dues selenoproteïnes. Hem pogut observar que l’alineament no és gaire bo, ja que s’oberva que molts pocs aminoàcids estan aparellats. Però aquests són resultats que esperàvem ja que estem comparant proteïnes de dos espècies molt llunyanes filogenèticament.

Mitjan�ant el programa Seblastian, hem pogut veure que aquesta selenoproteïna no conté elements SECIS en la seva seqüència. Per tant, hem pogut concloure que la selenoproteïna TR1 no es troba gaire conservada en l’evolució ja que l’alineament obtingut és bastant dolent i a mé no hi ha elements SECIS en la seva seqüència.

TR2

Al fer el Blast d’aquesta proteïna ens surten 7 hits. El primer és el que té l’E–value més alt però en fer l’alineament veiem que queda molt malament. Per això provem el segon hit, aquest té un E value de 3e–29 i correspon a l’scaffold JH882094.1, concretament a la cadena positiva. El hit dura 475 aminoàcids i la selenocisteïna es troba a la posició 474.

En fer l’exonerate veiem que el row score és de 2310. El T–coffe dona un alinemaent molt bo que té un Score de 100 i una llargada de 475. En veure que l’alineament era tant bo hem decidit fer l’estudi de SECIS. El programa Seblastian ens indica que hi ha un element SECIS que conmença a la posició 967 3’ UTR, l’score del qual és 29.83.

Totes aquestes dades ens porten a concloure que la proteïna TR2 està molt conservada entre les dues espècies comparades, ho afirmem gràcies a la gran homologia entre els alineaments i la presència de SECIS pròxims a la seqüencia de la selenoproteïna.

TR3

La seqüència que hem triat com a query és de l’espècia Bos taurus. En fer el Blast obtenim 14 hits, però només 6 tenen valors d’E–value destacables. Vam començar centrant–nos en el primer hit, situat a l’scaffold JH883751.1, amb un E–value de 4e–45 i en el mateix sentit que l’anotació (+). Però amb aquest hit no vam obtenir un alineament gens bo, fet que ens va portar a intentar–ho amb el segon hit. Aquest correspon a l’scaffold JH883395.1, té un E–value de 1e–37 i es troba també en el mateix sentit que l’anotació (+). Amb aquest segon hit és amb el que hem obtingut l’alineament òptim de les seqüències proteiques.

La proteïna descrita per l’exonerate té una raw score de 2816 i presenta 15 exons i 14 introns. A partir del T– coffee hem obtingut un alineament molt bo, amb una llargada de 565 aminoàcids i un score de 100. Finalment, hem observat que hi ha un element SECIS mitjançant Seblastian. Aquest es troba a la regió 3’ UTR i té el seu inici a la posició 136 downstream i un score de 17.61.

Considerant l’alineament força òptim que hem obtingut amb el T– coffee i l’element SECIS trobat, podem concloure que aquesta selenoproteïna es troba ben conservada evolutivament; la seva seqüència roman intacta als genomes de les espècies Bos taurus i Bos grunniens mutus, incloent la selenocisteïna.