|
Per a poder realitzar un anàlisi correcte del control transcripcional de TRPV4, cal tenir en compte tant la informació procedent de la conservació dels nucleòtids, com la referent als factors de transcripció predits per Promo i Transfac-Match. Per a poder formular hipòtesis significatives, és necessari buscar factors de transcripció que s'uneixin en zones conservades del promotor i dels quals es disposi de bibliografia que permeti relacionar la funció d'aquest amb els processos en què està implicat el calci.
- 1. Conservació del promotor
- 2. Predicció de llocs d'unió a FT
- 3. Validació de les prediccions filtrades
- 3.1 Implicació en la hipertensió
- 3.2 Implicació en el sistema immunitari
- 3.2 Implicació en l'asma
- 4. Localització dels FT predits
1.Conservació del promotor
El primer aspecte que analitzem és la localització de les regions més conservades del promotor de TRPV4 d'Homo sapiens respecte les 12 seqüències ortòlogues.
En aquest primer gràfic podem observar les regions conservades (respecte Homo sapiens) en cada una de les espècies amb què hem fet l'aliniament local mitjançant el programa SMM de Castillo-Davis.
En aquest segon gràfic es mostren les regions del promotor de TRPV4 d'Homo sapiens que es troben conservades a un mínim de quatre espècies.
Podem observar doncs, que el nombre de regions conservades en quatre, cinc o sis espècies es força elevat. En canvi, només s'observen tres regions que es trobin conservades en 7 espècies i d'aquestes tan sols dues es troben conservades en vuit organismes. 
2.Predicció de llocs d'unió a FT
Com ja s'ha esmentat en l'apartat de Mètodes, la predicció de llocs d'unió a factors de transcripció es fa mitjançant Promo i Transfac-Match i s'obté un nombre molt elevat de possibles regions. Per tant, és necessari filtrar els resultats per intentar reduir falsos positius. El primer filtratge es fa a partir de l'estudi de la coincidència entre els fragments de seqüència predits per Promo i Transfac-Match i les regions més conservades. En el següent gràfic doncs, es representen les prediccions de llocs d'unió de factors de transcripció que coincideixen amb les regions del promotor de TRPV4 conservades en un mínim de sis espècies.
En aquest gràfic es pot observar que hi ha un nombre important de factors de transcripció predits que s'uneixen a les regions conservades en més de 6 espècies. Concretament, es tracta de 22 factors de transcripció i 69 localitzacions diferents, ja que hi ha factors de transcripció que podrien unir-se a més d'una regió. Tenint en compte l'elevat nombre de prediccions que han superat el primer filtrat, es fa imprescindible una altra selecció, ja que no és possible que realment s'uneixin 69 factors de transcripció.
3.Validació de les prediccions filtrades
Degut a la necessitat de fer un nou filtratge per descartar falsos positius, es fa una recerca bibliogràfica que permeti obtenir informació que validi alguns dels resultats i en descarti d'altres. Abans d'iniciar la cerca exhaustiva, es procedeix a obtenir una senzilla descripció de cada un dels facotrs de transcripció predits.
AP-2α (activator protein 2 alpha): està implicat en l'expressió d'adrenomedulina, que és un pèptid hipotensor. També s'ha relacionat amb el control de l'expressió gènica específica de queratinòcits i amb la regulació negativa de la transactivació exercida per c-Myc.
|
c-Ets-1: es troba en nivells d'expressió elevats en cèl·lules T no activades. Els nivells d'expressió disminueixen després de la inducció cel·lular.
|
FOXP-3 (forkhead box protein P3): té un paper essencial en les cèl·lules T, i està implicat en els mecanismes moleculars que controlen la tolerància immunitària.
|
FOXD-3: es tracta d'un repressor transcripcional amb activitat reguladora en la diferenciació embriònica primerenca. A l'inici de l'embriogènesi es tracta d'un factor ubicu, durant el desenvolupament la seva expressió es restringeix a nivell de sistema nerviós.
|
GR (glucocorticoid receptor): presenta dues variants d'splicing: α i β, les quals difereixen en el domini C-terminal. GR s'uneix a la hormona, es transloca al nucli, i GR-α activa la transcripció de gens que presenten elements de resposta per aquest factor, a diferència de GR-β el qual no activa gens de resposta a glucocorticoides coneguts.
|
HNF-3α (hepatocyte Nuclear Factor 3 alpha): s'expressa a nivell hepàtic i a nivell pulmonar principalment.
|
Hox 9-10: ambdós factors de transcripció estan implicats en el desenvolupament embrionari.
|
IK-1 (ikaros 1): està implicat en el desenvolupament del llinatge limfoide.
|
IRF-1 (interferon regulatory factor 1): participa en diverses funcions entre les quals destaquen la regulació de l'expressió d'interferó-β i de gens induïts per interferó, el desenvolupament normal de timòcits i la inducció de l'expressió d'òxid nítric en macròfags.
|
MAZ (myc-associated zinc finger protein): s'uneix amb elevada especificitat a un element de regulació del promotor P2 del gen c-myc. c-Myc és un factor de transcripció implicat en la regulació de gens que afecten el creixement cel·lular i la diferenciació. La desregulació en l'expressió d'aquest factor de transcripció contribueix potencialment a la neoplàsia i l'apoptosi.
|
MEF-2A (myocyte enhancer-specific factor-2a): s'expressa en múscul llis, estriat i cardíac i en menor mesura en placenta, pulmó i ronyó. És un factor de transcripció involucrat en miogènesi i coopera amb els factors miogènics bHLH per a l'activació de l'expressió en múscul esquelètic.
|
p53: està implicat en el control del cicle cel·lular.
|
Pax-5: és un regulador del desenvolupament de cèl·lules B. Actua sinèrgicament i interactua directament amb c-Ets-1.
|
RXR-α (retinoid X receptor alpha): s'expressa específicament a nivell de l'epidermis en queratinòcits. És un receptor nuclear que està implicat en diverses funcions, tant durant el desenvolupament com en la resta d'etapes.
|
STAT-1β: està implicat en la inducció de l'expressió d'interferó.
|
STAT-4 (signal transducer and activator of transcription 4): participa en la regulació de la resposta inflamatòria.
|
TFIID (o TATA-binding protein): té un paper principal en l'activació de gens eucariòtics transcrits per la RNA polimerasa II. TFIID s'uneix especificament a la TATA box del promotor, la qual es troba propera a l'inici de transcripció.
|
TFII-I (general Transcription Factor II-I): interactua amb la maquinària de transcripció bassal coordinant la formació d'un complex multiproteic.
|
XBP-1 (x-box binding protein 1): s'uneix als elements X-box dels gens MHC de classe II.
|
A partir d'aquí, la cerca bibliogràfica s'ha fet simultàniament en tres línies. D'una banda, tenint en compte publicacions que postulen una possible implicació de TRPV4 en la hipertensió i l'asma, s'han buscat estudis i investigacions que aportin informació rellevant. D'altra banda, a partir de les descripcions anteriors, es pot comprovar que hi ha un nombre important dels factors de transcripció predits (8) que estan implicats en el sistema immunitari. Per aquest motiu, també s'ha realitzat una recerca bibliogràfica dirigida a esbrinar la possible implicació de TRPV4 en el sistema de defensa.
3.1 Implicació en la hipertensió
D'entre els factors de transcripció anteriors s'ha trobat informació rellevant que els relacioni amb la hipertensió en els següents:
| - MEF-2A(myocyte enhancer-specific factor-2A). S'expressa preferentment en les cel·lules musculars llises, estriades i cardíaques, les quals estan sotmeses a importants variacions en la concentració de calci intracel·lular. El fet que TRPV4 presenti un element de resposta a MEF-2A, implica que podria presentar expressió específica o preferent en teixit muscular.
Les cèl·lules musculars llises es troben en els vasos sanguinis. En resposta a diversos factors externs que actuen sobre aquestes cèl·lules, es produeixen variacions en la concentració de calci intracel·lular. Aquestes variacions de calci es tradueixen en diferents estats de contracció de la paret muscular dels vasos sanguinis. La desregulació de la concentració de calci és el que pot portar a la hipertensió, ja que la contracció fa augmentar la resistència en els vasos sanguinis provocant un augment de la tensió arterial. Si aquest procés no està regulat de manera adequada, pot haver-hi patologies importants. La hipotètica expressió de TRPV4 en les cèl·lules del múscul llis, podria relacionar-lo amb la hipertensió [7][8].
S'ha demostrat que existeix un elevat nivell d'expressió de MEF-2A en l'endoteli d'artèries coronàries, fet que recolzaria la hipòtesi de la implicació de TRPV4 en la hipertensió arterial. Certs estudis han descrit la importància de MEF-2A en una variant autosòmica dominant de la malaltia arterial coronària (CAD) i l'infart de miocardi (MI). MEF-2A seria un candidat potencial a ser un dels causants de CAD/MI, ja que es postula que la malaltia pot estar causada per la delecció de set aminoàcids en MEF-2A [9][10].
|
| - GR. L'element de resposta al receptor nuclear de glucocorticoides és un altre possible factor de transcripció que relaciona TRPV4 amb la hipertensió, si tenim en compte que els glucocorticoides són reguladors importants de l'homeòstasi d'electròlits i de la pressió arterial. En resposta a la unió de cortisol al receptor nuclear, aquest es transloca al nucli on activa la transcripció d'aquells gens que presenten elements de resposta a GR, entre ells podria figurar-hi TRPV4. Per tant, si els glucocorticoides estan relacionats amb l'augment de la pressió arterial i aquests modulen l'expressio de TRPV4, es podria relacionar la funció de TRPV4 amb la tensió arterial [11][12].
|
| - AP-2α. Finalment, basant-nos en la bibliografia consultada, TRPV4 també podria participar en el control de la tensió arterial mitjançant la regulació a través de AP-2α. Aquest factor està implicat en l'expressió d'adrenomedulina que és un pèptid hipotensor. Per tant, si AP-2α promou l'expressió d'adrenomedulina i TRPV4 podria presentar un element de resposta al mateix factor de transcripció, es podria donar un cas de coexpressió, que prendria importància en el cas que ambdós estiguessin implicats en el control de la tensió arterial [13].
|
3.2 Implicació en el sistema immunitari
Com ja s'ha esmentat anteriorment, s'ha considerat rellevant el fet que 9 dels 22 factors de transcripció predits que han passat el primer filtrat es relacionin amb el sistema immunitari. Són els següents:
- c-Ets-1
- FOXP-3
- IK-1
- IRF-1
- Pax-5
- STAT-1β
- STAT-4
- XBP-1
Aquesta coincidència permet hipotetitzar la implicació de TRPV4 en la resposta immunitària. No s'ha trobat cap article en la bibliografia disponible que relacioni directament TRPV4 amb immunitat, de manera que la cerca s'ha ampliat en primera instància a altres membres de la familia TRPV i posteriorment, a la resta de subfamílies de TRP. Mitjançant aquest procediment, s'han trobat diversos articles que relacionen els membres de la família TRPM amb el sistema imunitari [14][15]. Tenint en compte que TRPV i TRPM pertanyen a la mateixa família i tenen cert grau d'homologia, es podria postular la participació de TRPV en la resposta immunitària.
Un nombre important dels membres de la família de canals catiònics TRPM s'expressen en cèl·lules del sistema immunitari, dels quals el que s'expressa més específicament en el context immune és TRPM2. Aquest canal s'expressa en limfòcits T i B, granulòcits, cèl·lules del llinatge monocític, cèl·lules de la microglia (macròfags localitzats al sistema nerviós central), macròfags i cèl·lules dendrítiques.
S'han proposat diversos escenaris on els canals catiònics de calci TRPM2 s'activarien, permetent l'entrada de calci a la cèl·lula. Una d'aquestes hipòtesis seria la participació de TRPV2 en l'estrés oxidatiu. Els agents oxidants causen un ràpid increment de la concentració de calci en diversos tipus cel·lulars i, a través de diferents vies de senyalització, poden conduir en últim terme a la mort cel·lular. En cèl·lules T, l'activitat dels factors de transcripció NK-KB i AP-1 queda afectada per alteracions en l'homeòstasi redox. Molècules de senyalització en limfòcits com les tirosin kinases i les fosfatases, entre altres, es veuen afectades de manera directa per l'estrés oxidatiu. Donat que totes aquestes vies de senyalització estan regulades en certa mesura per calci, si TRPM2 s'expresés en aquest context, podria modular qualsevol de les vies descrites.
3.2 Implicació en l'asma
L'asma és una malaltia crònica pulmonar. Les tres característiques principals de la patologia són:
Obstrucció de la via aèria total o parcialment reversible, o bé espontàniament o amb tractaments.
Inflamació bronquial i fibrosi dels bronquis.
Hiperreactivitat bronquial o resposta immunològica augmentada degut a certs estímuls.
Es pot veure com l'asma té un component muscular, un component inflamatori i un component d'hiperreactivitat.
MEF-2A és un dels factors de transcripció amb possible lloc d'unió al promotor de TRPV4. Aquest factor s'expressa, entre altres teixits, en el múscul llis, que és el múscul present en els bronquis. La contracció inadequada del múscul bronquial és el que provoca l'obstrucció de les vies aèries. TRPV4 podria ser un dels canals de calci implicats amb la contracció del múscul llis bronquial.
HNF-3α es localitza en les cèl·lules de Clara del pulmó i regula l'expressió de uteroglobina. Aquesta proteïna és un factor antiinflamatori. Tenint en compte que l'asma té un component inflamatori, HNF-3α i uteroglobina hi podrien estar implicats. HNF-3α regula una proteïna antiinflamatòria i podria regular TRPV4. Aquesta hipotètica relació podria indicar una implicació de HNF-3α en l'asma, mitjançant TRPV4 i uteroglobina [16][17][18].
4. Localització dels FT predits
Com ja s'ha esmentat, d'alguns dels factors de transcripció es disposa de més d'una possible regió d'unió al promotor de TRPV4. Per tal de seleccionar-ne una d'elles, s'utilitzarà el valor de dissimilaritat que proporciona Promo. La dissimilaritat és el paràmetre que indica el grau de no concordança entre la seqüència i la matriu de pesos utilitzada per predir la regió d'unió al factor de transcripció corresponent. En cada cas, s'escollirà el resultat amb un valor de dissimilaritat més baix. En la taula següent, s'exposen els factors de transcripció amb les possibles localitzacions i el valor de dissimilaritat de cada una d'elles.
| AP-2α |
| 1197-1202 |
| 1411-1416 |
| 1785-1790
|
|
|
|
| c-Ets1
|
1782-1788
|
6,04
|
TTTCCAG
|
| FOXP3
|
| 1138-1143
|
| 1144-1149
|
| 1416-1421
|
|
|
|
| GR |
| 367-373 |
| 521-527 |
| 1143-1149 |
|
|
|
| HNF-3α |
| 359-366 |
| 1133-1140 |
| 1278-1292 |
| 1779-1786 |
|
|
| TAAAAATA |
| AAAAAATA |
| AATTTAAATAAAATT |
| CATTTTCC |
|
| Ik-1 |
560-572 |
7,12 |
TCCCAGCATCTTC |
| IRF-1 |
1782-1790 |
8,08 |
TTTCCAGGC |
| MEF-2A |
|
|
|
| Pax 5 |
1415-1421 |
9,55 |
GGGCAAC |
| STAT-1β |
1781-1790 |
11,59 |
TTTTCCAGGC |
| STAT-4 |
1781-1786 |
1,47 |
TTTTCC |
| TFIID |
| 365-371 |
| 1127-1136 |
| 1781-1787 |
|
|
| TACAAAA |
| TAATAAAAAA |
| TTTTCCA |
|
| TFII-I |
1781-1786 |
9,51 |
TTTTCC |
| XBP-1 |
563-568 |
12,07 |
CAGCAT |
En els casos en què es disposa de més d'una localitzacó possible, s'ha escollit la de valor de dissimilaritat menor. En alguns dels factors de transcripció hi ha dos valors idèntics de dissimilaritat; es consideren ambdós.
|
|
