Anàlisi
Estudi de la distribució de caixes que corresponen a llocs de reconeixement del factor de transcripció CREB


Taula de continguts:


Introducció
La proteïna CREB (cyclic AMP-responsive element-binding protein) és un factor de transcripció clau que estimula l’expressió de nombrosos gens en resposta a factors de creixement, hormones, neurotransmissors, fluxes iònics i senyals d’estrès. Aquests elements extracel·lulars activarien un conjunt de missatgers secundaris que transduirien la senyal via rutes quinasa fins l’activació de CREB, que té localització nuclear. Aquesta activació es porta a terme mitjançant la fosforilació de la serina 133 d’aquest factor. Tant CREB com els seus paràlegs ATF1 i CREM actuen formant dímers i activant la transcripció de gens corresponents a un ampli ventall de processos biològics, incloent-hi el metabolisme glucídic i la supervivència cel·lular i complexes funcions neuronals com la memòria i l’aprenentatge.

Figura 1: vies d'activació de CREB


Els membres de la familia CREB s’uneixen al DNA per mitjà d’un domini proteic bàsic anomenat leucine zipper (bZIP). Aquest motiu és capaç de reconèixer una seqüència palindròmica curta present en el genoma: l’element CRE (cAMP response element). Aquesta seqüència es localitza freqüentment a la regió promotora proximal al lloc d’inici de transcripció (TSS: transcription starting site). Estudis realitzats sobre nombrosos promotors que responen a AMPc han permès la identificació d’un palíndrom consens -TGACGTCA- que és reconegut pel dímer CREB amb alta afinitat.
Altres estudis indiquen que CREB està unit constitutivament als motius CRE fins i tot en absència d’agonistes. Aquesta unió es produeix molt sovint molt a prop de les capces TATA del mateix promotor. Per aquest motiu, la unió de CREB al promotor sembla estimular interaccions cooperatives amb altres factors de transcripció per tal de facilitar el reclutament dels complexes RNA polimerasa II.

Tornar a Taula de continguts



Objectius
L’objectiu del nostre estudi és analitzar la possible cooperació funcional entre els factors d’unió als motius CRE i TATA del DNA. Volem estudiar aquesta interacció putativa comparant la distribució dels dos motius en diferents seqüències corresponents a diferents regions gèniques humanes.

Tornar a Taula de continguts



Materials i Mètodes
Per realitzar el nostre estudi hem utilitzat dos fitxers que contenen seqüències corresponents a diferents regions gèniques en format FASTA:

Per tal d’analitzar la distribució dels motius CRE i TATA sobre aquestes seqüències, hem utilitzat dues expressions regulars que defineixen la seqüència consens de cadascun dels motius. Degut a que els elements de resposta són seqüències relativament curtes, hem precisat les expressions per tal de limitar la búsqueda sobre les seqüències. Així, les expressions regulars utilitzades en format Perl són les següents:

Hem realitzat la búsqueda d’aquests motius sobre les seqüències mitjançant el programa motius.pl, descrit detalladament a la secció PROGRAMA. Els resultats obtinguts al fitxer de sortida s’han processat i representat en forma d’histogrames a partir del programa SPSS v11.0.

Tornar a Taula de continguts



Resultats

Figura 2. Distribució dels motius CRE i TATA en seqüències promotores i codificants (clica per veure els gràfics ampliats).
(A) i (B) Histograma que recull la freqüència de match registrada a cada intèrval de posició de les seqüències promotores. Els intèrvals són de 100 nucleòtids en A i 5 nucleòtids en B. S’indica amb una fletxa la posició del TSS. La posició 0 a l’eix d’abcises correspon al nucleòtid –674 respecte el TSS. La posició 1000 correspon al nucleòtid +325.
(C) i (D) Histograma que recull la freqüència de match registrada a cada intèrval de posició de les seqüències codificants. Els intèrvals són de 100 nucleòtids. La posició 0 correspon a l’ATG (indicat amb una fletxa).
Q: nombre de seqüències amb match respecte el total de seqüències.
Desv. típ: desviació estàndard
Media: mitjana
N: nombre total de match

En el cas de les seqüències promotores, el nombre total de match ocorreguts sobre les seqüències és prou coincident en ambdós motius. Analitzant visualment el llistat registrat al fitxer de sortida  trobem que la major part de les seqüències promotores que contenen TATA també contenen CRE (fitxers de sortida de A i B).

Els resultats suggereixen una tendència dels motius CRE i TATA a distribuir-se en regions coincidents. La figura 2A mostra una clara prevalència del motiu TATA a localitzar-se a la regió inmediatament anterior al lloc d’iniciació de transcripció. Aquest fet coincideix amb la funció d’aquest motiu relacionada amb el reclutament de la maquinaria de transcripció. Addicionalment, a la figura 2B s’aprecia com la distribució predominant del motiu CRE es dóna a les 100 posicions precedents al TSS. Tenim, per tant, que tant les capses TATA com les capses CRE es localitzen molt properes al lloc d’iniciació de transcripció, i que en la majoria dels casos apareixen alhora.

En l’anàlisi realitzat sobre les seqüències codificants, trobem que el nombre de match és molt superior que en el cas anterior, especialment amb el motiu TATA (apareixen match vàries vegades per seqüència). A més, no és possible establir un patró de distribució dels motius al llarg de les seqüències a partir dels histogrames. Així, l’aparició de coincidències al llarg d’aquestes seqüències seria deguda a l’atzar, que permetria l’aparició dels motius en gran quantitat degut a la curta longitud d’aquests. Els resultats serveixen de control negatiu respecte els resultats anteriors, donat que permeten descartar una distribució funcional sobre seqüències no promotores (fitxers de sortida de C i D).

Tornar a Taula de continguts



Discussió
Els estudis realitzats fins al moment sobre la proteïna CREB i la seva localització nuclear han permès afirmar que es tracta d’un factor de trancripció activat per múltiples vies i que s’uneix amb alta afinitat a determinades regions promotores del genoma. És de vital importància reconèixer els patrons d’activació i de cooperació que segueix aquest factor per tal d’esbrinar detalladament quin ampli ventall de gens és capaç d’activar i en quines circumstàncies. Un primer pas en aquesta labor és determinar quan CREB interacciona amb factors d’unió a TATA i en quins promotors ho fa. Una aproximació a aquesta cooperació és realitzar un anàlisi computacional que permeti relacionar el patró de distribució de CRE en determinades regions del genoma amb el de TATA. Aquest estudi, realitzat sobre una mostra representativa de seqüències promotores, és el que s’ha realitzat en aquest treball. Els resultats obtinguts inviten a pensar que realment es produeix una bona correlació entre la distribució d’ambdós elements. Aquesta dependència de localització suggereix una funció cooperativa entre els factors que s’uneixen a aquests elements per impulsar la transcripció d’un subconjunt específic de gens activats per CREB. Aquest fet permetria limitar o, si més no, encaminar la búsqueda de quins gens són activats per CREB i per què.

Tornar a Taula de continguts