EhSep2
A partir de la llista proporcionada de les altres selenoproteïnes (no humanes), s'ha obtingut la seqüència de pèptids d'aquestes del disc8 i s'ha realitzat un tBLASTn contra el genoma de L. braziliensis. Posteriorment, hem analitzat els resultats obtinguts i s'han observat hits significatius en dues selenoproteïnes: EhSep2 i SelTryp.
Protein disulfide-isomerase-like protein EhSep2
La EhSEP2 és una selenoproteïna que pertany a la familia de les tiorredoxines i presenta homologia amb la proteïna disulfit-isomerasa. Aquesta és una proteïna oxidoreductasa molt abundant que catalitza la formació, reducció i isomerització dels enllaços disulfurs de les proteïnes en el reticle endoplasmàtic durant el plegament de les proteïnes. La presència d'una selenocisteïna en lloc d'una cisteïna en un dels llocs actius conservats, no permet la formació dels enllaços disulfur en ambients deficitaris de seleni.
Per tal de determinar si la nostra espècie conté EhSep2, hem realitzat un tBLASTn per veure si hi ha algun hit prou significatiu entre les EhSep2 presents en la SelenoDB i GeneDB, i en el nostre genoma. A continuació es mostren els resultats.
Analitzant els resultats, veiem que hi ha diversos hits significatius dels quals escollim aquell que té un E-value més petit, que es correspon a l'alineament del contig "gi|140256453|ref|NC_009276.1|" amb un E-value de 1e-16 i un score de 84.
Tanmateix, en l'alineament del tBLASTn, podem observar que el residu selenocisteïna de la selenoproteïna EhSep2 s'alinea amb una cisteïna del genoma de L.braziliensis, fet que ens permet concloure que possiblement la proteïna de L.braziliensis sigui un homòleg de cisteïna.
Tot seguit s'ha procedit a extreure la seqüència genòmica d'interès amb la qual s'ha produït l'alineament, localitzada al contig: "gi|140256453|ref|NC_009276.1|".
Realitzant un tBLASTn amb l'opció -m 9, s'ha obtingut més informació del nostre alineament, així com l'inici i final de la regió genòmica de L.braziliensis on es produeix l'alineament, i que la seqüència a extreure és en la strand +.
A partir d'aquesta regió es determina la seva estructura gènica, és a dir, els exons i els introns presents en aquesta subseqüència. Això ho obtenim gràcies al programa Genewise, el qual ens alinea aquesta subseqüència juntament amb la EhSep2 i ens localitza els exons i els introns. Els resultats es mostren a continuació.
A partir d'aquí, s'ha agafat el cDNA predit pel programa Genewise i s'ha realitzat un fastatranslate per tal d'obtenir els 6 possibles ORF. Per tal de poder determinar quin dels 6 correspon a la possible seqüència codificant de la selenoproteïna, s'ha realitzat un BLASTp entre els diferents ORFs contra la proteïna EhSep2. Llavors, s'ha extret la seqüència protèica a partir del millor hit obtingut per BLASTp. Aquesta presenta un E-value de 5e-21 i un score de 82. A continuació es mostra la seqüència proteica predita corresponent a la EhSep2 de L.braziliensis:
>subseq(430797,6314).[2994:3314].sp [translate(1)] AEAEMVELNPANFHKIVKDPSKNVFVMFYAPWC GHCNNMKPVWLELADNYPISEDIIIARIDASAYRGIA KEFGISGFPTLKFFPKRDKSGANQYSGPRELSAFRSY
Analitzant la seqüència, veiem que presenta un C en posició 33, indicatiu de que possiblement la nostra predicció es tracti d’un homòleg de cisteïna.
Per acabar de confirmar les nostres sospites, hem realitzat un SECISearch (paràmetres: pattern: loose (canonical and non-canonical; core structure energy: -5; overall structure energy: -11) on vam obtenir una predicció d´estructura SECIS, tot i que no presentava un valor de COVE score molt alt (0).
També hem realitzat per mitjà del programa Interpro una cerca de dominis proteics, mitjançant el qual hem localitzat el domini característic de les Thioredoxin.
