ANÀLISI DE FAMÍLIES DE PROTEÏNES

PROTEÏNA LIFEGUARD

Introducció

Aquest treball caracteritza una família de proteïnes, partint d'una seqüència problema (Lifeguard Q8K1F6 de Mus musculus). En primer lloc, analitzarem les seqüències de proteïnes que presentin un bon alineament amb la nostra proteïna (Programes: Swissprot, BLASTP, ClustalW, Pfam). Seguidament, estudiarem les relacions filogenètiques entre les proteïnes escollides tot relacionant les funcions respectives (Programes: ClustalW (Pasteur i EBI), TreeView). I per últim, estudiarem els gens codificants pels membres d'aquesta família proteica (cromosoma, exons) per humà i ratolí (Programes: ENSEML, NCBI).

1. Anàlisi de les seqüències de proteïnes
2. Distribució filogenètica
3. Anàlisi dels gens que codifiquen per membres d'aquesta família de proteïnes (Mus musculus i Homo sapiens
4. Referències
5. Autores

1.Anàlisi de les seqüències de proteïnes

Entrem la nostra proteïna a la base de dades de Swissprot. Hi trobem informació sobre funcions, seqüència d'aminoàcids en format FASTA i format TrEMBL, origen, referències...
Prenem la seqüència en format FASTA i fem córrer el programa BLASTP. Aquest programa compara la proteïna entrada amb totes les de la base de dades en parells (dos a dos) a l'atzar, és a dir, la proteïna problema amb una proteïna a l'atzar, després respecte una altra proteïna també a l'atzar, i així successivament. Atribueix a cada alineament una puntuació ("score") i un valor d'esperança ("E-value").
BLASTP té un match amb altres bases de dades de dominis proteics (Pfam, COG). En les bases de dades de dominis, la proteïna que entrem és comparada amb el conjunt de proteïnes semblants que troba dins la base de dades. Les seqüències d'aminoàcids conservades són més significatives que si usem BLASTP ja que estan contextualitzades únicament dins el grup de proteïnes més similars.

Domini conservat

Les barres en vermell indiquen la predicció del domini conservat per a la proteïna "Lifeguard Q8K1F6" de Mus musculus, segons les bases de dades Pfam i COG. El domini UPF0005 pertany a una família proteica no caracteritzada ("Uncharacterized Protein Family") segons la base de dades Pfam. I segons la base de dades COG el domini COG0670 és un domini de proteïna integral de membrana que interacciona amb FtsH.
Les dues bases de dades suporten que el domini de conservació es troba en l'extrem C-terminal de la seqüència proteica, aproximadament entre els aminoàcids 140 i 310.

Escollim les seqüències proteiques de diferents espècies, inclosa la proteïna Q8K1F6 amb funcions diverses que compleixin un "score" més alt (millor alineament) i una esperança ("E-value") màxima de 0.001 (si superem aquest rang els valors no són estadísticament significatius). Obtenim així una mostra representativa de diferents espècies per tal de relacionar-les evolutivament.

Mitjançant el programa ClustalW (EBI) realitzem l'alineament múltiple de les seqüències proteiques escollides per tal de limitar l'alineament a la zona conservada. Aquest és el resultat.

Paral.lelament, hem cercat la seqüència del domini UPF0005 (Mus musculus) a la base de dades Prosite i comprovem que realment coincideix amb la seqüència conservada deduïda a partir de l'alineament múltiple anterior (ClustalW).

                         FPAGHHEHFTTFSWDDQKVRRLFIRKVYTILLVQLLVTLAVVALFTFCDVVKDYVQANPGWYWASYAVFFATYLTLACCS
                            
pfam:UPF0005                            <================================================================

                         GPRRHFPWNLILLTIFTLSMAYLTGMLSSYYNTTSVLLCLVITALVCLSVTIFSFQTKFDFTSCQGVLFVLLMTLFFSGL
        
pfam:UPF0005             ================================================================================

                         LLAVLLPFQYVPWLHAVYAVLGAGVFTLFLAFDTQLLMGNRRHSLSPEEYIFGALNIYLDIIYIFTFFLQLYGTNRE
                                                              
pfam:UPF0005             ===========================================================================> 

---

2.Distribució filogenètica

Prenem les seqüències seleccionades prèviament per tal de relacionar-les evolutivament en un arbre filogenètic (pel mètode de "Neighbour joining"). Els dos programes clau són: ClustalW (Pasteur) i TreeView. L'opció "bootstraping" per l'arbre "NJ" calcula 1000 vegades l'alineament previ a l'atzar i dóna una mesura de robustesa (nombre de vegades que es genera el mateix arbre), en el nostre cas, dóna exactament el mateix arbre i amb una elevada robustesa (pròxima a 1000).

En l'arbre, observem una primera ramificació on s'agrupen d'una banda les lifeguards de mamífer relacionades amb les NMDAs també de mamífer i de C. elegans; d'altra banda una segona ramificació composta per Z-protein humana directament relacionada amb Camelpox virus i secundàriament amb P. falciparum, espècies que infecten i parasiten l'home respectivament; i un tercer cluster protagonitzat per proteïnes d'insectes (NMDAs de Drosophila sp. i agCP6292 d'Anopheles gambiae).

Comentarem les funcions de les diferents proteïnes. Com veiem a l'arbre, les proteïnes a distància filogenètica més propera són les lifeguards (de Rattus norvegicus, Homo sapiens i Mus musculus). La proteïna lifeguard pot unir-se al receptor de Fas però no regula l'expressió de Fas ni interfereix amb la unió d'un agonista. Lifeguard és una molècula anti-apoptòtica (protegeix les cèl.lules de l'apoptosi induïda per Fas) (1). La maquinària intracel.lular responsable de l'apoptosis és similar en totes les cèl.lules animals. Aquesta maquinària depèn d'una família de proteases que hidrolitza les proteïnes diana en el seu costat carboxil dels àcids aspàrtics (d'aquí el seu nom, c-caspasa). Les caspases són sintetitzades com a precursors inactius (procaspases) que poden activar-se per l'esmentada ruptura. Així, un cop desencadenada l'activació, té lloc una cascada de caspases (la qual provoca la degradació de proteïnes estructurals, de factors de transcripció, etc, acabant amb la mort cel.lular). L'activació de les procaspases pot ser induïda des de l'exterior de la cèl.lula mitjançant l'activació de receptors mortals presents a la superfície cel.lular. El lligand de Fas unit al receptor Fas activa la cascada (2). Lifeguard és present a les sinapsis de l'adult del Sistema Nerviós Central. En humà, lifeguard (KIAA0950) s'expressa en tots els teixits excepte melsa i placenta (1).

Els receptors NMDA (N-metil-D-aspartat) són els típics receptors ionotròpics (que formen un canal iònic) activats per l'aminoàcid glutamat. El glutamat és el neurotransmissor excitador més important en el SNC. Quan el receptor NMDA és activat, augmenta la permeabilitat de la membrana plasmàtica pel Calci. L'entrada de Calci a l'interior cel.lular comporta innumerables efectes postsinàptics. En repòs aquest receptor està bloquejat pel Magnesi (normalment present al medi extracel.lular). La suma d'ambdues propietats (permeabilitat al Calci i bloqueig pel Magnesi) el fan responsable de fenòmens de naturalesa plàstica implicats en els processos d'aprenentatge i memòria (3). El fet que Camelpox virus tingui aquest receptor suggereix que l'ha adquirit per infecció d'una cèl.lula hoste, possiblement d'Homo sapiens, per la seva proximitat evolutiva (reflectida a l'arbre filogenètic).

Z-protein és una proteïna eucariota integral de membrana relacionada amb GBP (Glutamate Binding Protein), és a dir amb NMDA. Té 7 dominis transmembrana, que pertanyen a la família BI1 (supressor apoptòtic de mamífers). La base de dades GO prediu la seva funció: regulador de l'apoptosi.

La proteïna transmembrana d'oligodendròcit (OTMP) també és una GBP. És una proteïna integral de quatre hèlix amb un loop extern i amb les regions N i C-terminals localitzades dins la cèl.lula. Es suggereix que OTMP és un receptor de senyalització amb un paper en la mielinogènesi (4).

La proteïna d'Anopheles gambiae és de funció desconeguda.

Tant les proteïnes lifeguard com els receptors NMDA contenen el domini BI1 (Bax inhibitor-1). El domini BI1 és similar a la família de proteïnes intracel.lulars Bcl-2 (que contribueix a regular l'activació de les procaspases). Alguns membres d'aquesta família (com el mateix Bcl-2 o Bcl-XL) inhibeixen l'apoptosi bloquejant l'alliberament del citocrom C (transportador d'electrons) del mitocondri (2).

Existeix una homologia significativa en la meitat C-terminal entre les proteïnes:

• Neural Membrane Protein 35 (NMP) de Rattus sp.
• Glutamate Binding Protein de Rattus sp.
• Drosophila NMDA receptor-associated protein
• dues proteïnes de funció desconeguda de C. elegans

demostrada per un article [PubMed] [Free Full Text] (1) trobat a la base de dades PubMed. Alhora, el contingut d'aquest article reflecteix una correlació entre NMDA i l'expressió de Fas i el seu lligand (FasL), i un important paper protector anti-apoptòtic de LFG implicat en aquesta correlació. S'ha observat expressió de Fas i FasL després d'injectar NMDA a l'hipocamp de ratolí (5). Malalties com leucèmia i Alzheimer (amb un component apoptòtic i el cromosoma 12q13 humà implicat) l'expressió i modulació de LFG pot tenir un important ús terapèutic quan la protecció davant de Fas és requerida.

Hem ampliat la informació d'aquest arbre amb altres proteïnes d'interès (que apareixen en el tercer bloc) i, a més a més, amb una seqüència d'un herpes virus humà (relacionat amb Lifeguard Q8K1F6 en l'article: (6)). En aquest article hi ha evidències d'homologia entre Lifeguard humana i la proteïna HCMVA (pertanyent a la família US12) de l'herpesvirus 5 humà, suggerint un paper anti-apoptòtic. Aquesta proteïna és integral de membrana, interacciona amb FtsH, i conté el domini UPF0005 amb subdomini BI1. En l'alineament múltiple de l'article citat es reflecteix el domini conservat UPF0005 entre membres de la família US12 d'Herpesvirus, lifeguard humana, i dues proteïnes humanes addicionals.
Mitjançant el programa ClustalW (EBI) realitzem un alineament múltiple de totes aquestes seqüències i una posterior representació de les relacions evolutives entre les diferents espècies implicades:

En aquest segon arbre, es manté la mateixa agrupació d'espècies i funcions plasmada en el primer arbre. Les quatre proteïnes (l'homòleg de NMP35 (14) i la Z-protein (16) de Mus musculus, NMDA receptor glutamate-binding chain (17) de Homo sapiens, i una proteïna relacionada d'Herpesvirus (15) humà) afegides s'integren en l'arbre sense desestructurar aquesta distribució. D'aquesta manera, la proteïna número 14 es relaciona directament amb la lifeguard (13) de la mateixa espècie (Mus musculus); la número 16 directament amb la seva homòloga Z-protein de Homo sapiens; la número 17 amb NMDA de rosegadors; i finalment, la número 15 dins el mateix grup que P. falciparum i Camelpox virus reflectint la possible adquisició de gens d'hostes humans, entre altres espècies, al llarg de l'evolució.

3.Anàlisi dels gens que codifiquen per membres d'aquesta família de proteïnes (Mus musculus i Homo sapiens)

Entrant a l'ENSEMBL la seqüència FASTA de la nostra proteïna de partida (Q8K1F6) per tal de córrer un BLASTP (córrer la proteïna contra la base de dades de l'ENSEMBL). El resultat és que el millor alineament no és suficientment significatiu per constatar que ENSEMBL conté la proteïna. Per tant, no podem mostrar l'estructura exònica de Q8K1F6.
Ja que no tenim un representant de Lifeguard en Mus musculus, partim de la Lifeguard d'Homo sapiens (KIAA0950). Prenem la seqüència humana en format FASTA i correm un BLASTP contra les proteïnes de Mus musculus d'ENSEMBL. Així trobem la seva proteïna homòloga en Mus musculus: Lifeguard Q9D6K4.
De la mateixa manera, a partir de la seqüència FASTA de la proteïna NMDA receptor glutamate-binding chain (Lag protein) de Mus musculus, trobem la seva homòloga humana: NMDA receptor glutamate-binding chain (GRINA).

Segons la base de dades Pfam, totes les proteïnes de la taula anterior comparteixen el domini conservat UPF0005. Els membres de la família UPF0005 es preveu que contenen 7 dominis transmembrana i que comparteixen la regió compresa entre el principi del 3er domini fins meitat del 4rt (1). La cerca per ENSEMBL de les proteïnes de Mus musculus mostra el domini conservat BI-1 (Bax inhibitor-1), mentre que per les proteïes de Homo sapiens mostra el domini conservat UPF0005. La base de dades INTERPRO caracteritza BI-1 com a subdomini del domini conservat UPF0005.
Segons la bibliografia (7), BI-1 és una proteïna integral de membrana evolutivament conservada en mamífers, implicada en la supressió de l'apoptosi. Conté múltiples segments transmembrana, com podem veure en totes les proteïnes de la taula.

Trobem evidència d'Splicing Alternatiu en Z-protein i en Lifeguard d'Homo sapiens. El primer cas, quatre transcrits generen quatre isoformes diferents de la Z-protein. En el segon cas, es tradueixen dues isoformes de la Lifeguard a partir de dos transcrits.

---

4.Referències

(1) Somia NV, Schmitt MJ, Vetter DE, Antwerp DV, Heinemann SF, Verma IM. LFG: An anti-apoptotic gene that provides protection from Fas-mediated cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999 October 26;96(22):12667–12672.

(2) Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science, 2002.

(3) Lerma J, Mora J, Prieto JS. Sinapsis monoaminérgicas y peptidérgicas. In: Delgado JM, Ferrús A, Mora F, Rubia FJ. Manual de Neurociencia. Madrid: Editorial Síntesis, 1998;233-234.

(4) Szuchet S, Plachetzki DC, Eaton KS. Oligodendrocyte transmembrane protein: a novel member of the glutamate-binding protein subfamily. Biochem Biophys Res Commun 2001 May 18;283(4):900-7.

(5) Shin SW, Park JW, Suh MH, Suh SI, Choe BK. Persistent expression of Fas/FasL mRNA in the mouse hippocampus after a single NMDA injection. Journal of Neurochemistry 1998;71,1773-1776.

(6) Holzerlandt R, Orengo C, Kellam P, Albà MM. Identification of New Herpesvirus Gene Homologs in the Human Genome. Genome Res 2002 Nov;12(11):1739-48.

(7) Xu Q, Reed JC. Bax inhibitor-1, a mammalian apoptosis suppressor identified by functional screening in yeast. Mol Cell 1998 Feb;1(3):337-46.

5.Autores

Marta Beltran Domingo (marta.beltran01@campus.upf.es)
Ariadna Echenique Vergés (ariadna.echenique01@campus.upf.es)