Para determinar el conjunto de proteínas que pertenecen a la familia Bcl2 se han hecho búsquedas de similitud en bases de datos partiendo de la secuencia de Bcl2 (P10415) de la base de datos Swissprot. Con la ayuda de Blastp e información sobre Bcl2 hemos ido delimitando nuestro grupo de proteínas de trabajo hasta  escoger 11 de ellas:

 

 

Nombre de la proteína (humano)

Cromosoma

Número de entrada de proteína

Número de entrada del gen (mRNA)

Bcl2 a

18q21.3

AAA51813

M13994

Bcl2 b

18q21.3

AAA51814

M13995

Bak

6p21.3-.2

CAB65626

NM_001188

Bax a

19q13.3-.4

Q07812

L22473

Bax b

19q13.3-.4

AAA03620

L22474

Bax g

19q13.3-.4

AAA03621

L22475

Bax d

19q13.3-.4

AAC50142

U19599

Bcl w

14q11.2-q12

Q92843

U59747

Bcl x

20q11.2

Q07817

Z23115

Bfl-1

15q24.3

AAC50438

U29680

Mcl-1

1q21

XP_041941

XM_041941

 

            Con la secuencia en formato FASTA de las proteínas elegidas hemos realizado un alineamiento múltiple con CLUSTALW  que nos ha servido para construir un árbol filogenético con PHYLIP: protdist, neighbor-joining, seqboot y consense. Para conocer las distancias evolutivas entre las proteínas de esta familia, primero hemos construido  un árbol filogenético con protdist y neighbor-joining. Después, mediante las mil matrices de distancias generadas por seqboot,  hemos extraído el árbol consenso. La imagen siguiente es un árbol consense con las distancias filogenéticas obtenidas en el primer  paso.

 

 

Lo primero que se observa en la imagen es la agrupación de les proteínas según su función. En la parte superior vemos todas las proteínas pro-apoptóticas (Bax y Bak) y en la inferior, las anti-apoptótcas (Bfl1, Mcl1, Bcl2, Bclx y Bclw).

Si lo analizamos más a fondo vemos como las proteínas se organizan en grupos según la estructura aminoacídica que contienen. En un extremo observamos los miembros Bax que contienen los dominios BH1 y 2 exactamente iguales y que se diferencian en los otros dominios por efecto del splicing alternativo. Después encontramos los dos miembros Bak, que aunque se generan por splicing alternativo presentan los mismos dominios BH1,  2, 3, TM y por ello los encontramos separados por una distancia evolutiva mínima. Las siguientes proteínas relacionadas son las Bcl. Por una parte encontramos Bcl2 a y b que se generan por splicing alternativo y presentan los 5 dominios de la familia por tanto se disponen también a muy poca distancia la una de la otra. Por otra parte está  Bcl w y x. El segundo está más cercano a Bcl2 ya que presenta los mismos dominios y el primero, por falta de BH3 y TM, se encuentra más alejado dentro de la misma rama. Los últimos miembros son Mcl1 y Bfl1. A la primera proteína sólo le  falta el dominio BH4 pero la distancia que la separa de las otras es considerable. Bfl1 sólo tiene BH1 y 2 pero aun así pertenece a la familia de las proteínas anti-apoptóticas (ver tabla en filogenia).

 

El árbol consenso nos proporciona un valor para cada rama, que se relaciona con el grado de robustez de ésta, y por tanto la certeza de que la posición no es debida al azar sino que en un alto porcentaje de los1000 árboles aparece de esta forma. La mayoría de las ramas de nuestro árbol llevan asociado un valor de bootstrap más grande de 850. Pero en algunos casos esto no se cumple:

 

*   El conjunto de BCL2 (a y b), BCLW y BCLX con el resto tiene un bootstrap de 374 (·). Nos hace pensar que estas tres secuencias, al ser las más homólogas entre sí, tienden a agruparse y  al compararlas con la familia entera, los alineamientos no obtienen un score demasiado alto y por ello la rama no es de una gran robustez.

 

*   La rama que une las proteínas Bax (A,B,C y D) y la que une este grupo más Bak (1 y 2) con el resto de proteínas tiene exactamente un valor de 542 (·). La razón es que los dos tipos de proteínas son miembros de la subfamilia pro-apoptótica Bax y también conservan una tendencia a agruparse con valores de bootstrap muy altos en las ramas internas mientras que observamos lo contrario con la rama que los une al resto.

 

Dominios BH (Bcl2 homology)        

 

*   BH1 y BH2: se encuentran en las proteínas anti-apoptóticas. Permiten heterodimerizar con Bax para reprimir la cascada de caspasas y, en consecuencia, la muerte celular.

            * Patrón consenso BH1:[LVME]-[FT]-x-[GSD]-[GL]-x(1,2)-[NS]-[YW]-G-R-[LIV]-

                                                     [LIVC]-[GAT]-[LIVMF](2)-x-F-[GSAE]-[GSARY]

 

* Patrón consenso BH2: W-[LIM]-x(3)-[GR]-G-[WQ]-[DENSAV]-x-[FLGA]-[LIVFTC]

 

 

*   BH3:se encuentra en las proteínas pro-apoptóticas (como Bax y Bak) y permite heterodimerizar con BclxL y Bcl2 para promover la apoptosis.

* Patrón consenso BH3: [LIVAT]-x(3)-L-[KARQ]-x-[IVAL]-G-D-[DESG]-[LIMFV]-

                                               [DENSHQ]-[LVSHRQ]-[NSR]

 

 

* BH4: está conservado en los miembros anti-apoptóticos y absente en los pro-apoptóticos (con excepción de BclxS). Este dominio permite la interacción con las proteínas reguladoras de la muerte celular como Raf1, Bad y Ced4.

          * Patrón de consenso BH4: [DS]-[NT]-R-[AE]-[LI]-V-x-[KD]-[FY]-[LIV]-[GHS]-Y-K-L-[SR]-Q-[RK]-G-[HY]-x-[CW]

 

 

De todos estos dominios BH1 y BH2 son esenciales para la función anti-apoptótica y se encuentran en todos los miembros  de esta subfamilia. Mientras que BH3 es el característico de la subfamilia pro-apoptótica.