La familia de proteínas Bcl2 se encuentra conservada en todos los animales y está implicada en la alteración de la permeabilidad de la membrana mitocondrial que resulta con la pérdida del citocromo C y la activación de la apoptosis Según los datos experimentales, Ced9 de C.elegans (Cizeau et al.), el cluster homólogo a Bcl2 de poríferas (Wiens M. et al.) y Drosophila (Zhang H. et al.) son versiones pro-apoptóticas. Según Aravind L. et al. la diferenciación entre las subfamilias pro y anti-apoptóticas debe haber surgido con la aparición de los celomados ya que uno de sus ancestros ya contenía una proteína con función anti-apoptótica. Ya en vertebrados podemos observar una gran diversificación de las dos subfamilias, sobretodo en la pro-apoptótica. Esta tendencia parece más importante en la subfamilia BH3 en la que se han identificado muchas con baja similitud entre ellas sobretodo en mamíferos. Por esto no queda muy claro si el dominio BH3 es funcionalmente relevante y si tienen un único ancestro común. Ha sido ésta la razón por la que hemos descartado utilizar esta subfamilia para nuestro análisis filogenético.

En vertebrados se observa un crecimiento en la complejidad de les proteínas y los dominios asociados a la apoptosis. En el caso de la familia de Bcl2 se debe principalmente a la duplicación de genes y a la emergencia de nuevos dominios mediante la modificación de los preexistentes o la reorganización de los mismos. Según Aravind L. et al las innovaciones en vertebrados en la señalización apoptótica y citoquinas relacionadas está unida a la evolución del sistema inmunitario y más en concreto a la aparición de nuevas líneas celulares que necesitan de vías reguladoras más especializadas.

El misterio más grande en la evolución de la apoptosis es la presencia de homólogos de la maquinaria reguladora en bacterias (Frade JM. et al.). El hecho que actinomicetos y cianobacterias codifiquen para la mayoría de dominios asociados a la apoptosis de la misma manera que lo hacen los eucariotas contrasta con su ausencia en otros tipos de bacterias como las arqueas. Esto sugiere la adquisición de estos genes por transferencia horizontal, más probable de bacterias a eucariotas que no al revés.

En conclusión podemos decir que la evolución del sistema apoptótico tiende al aumento de la complejidad en vertebrados en comparación con nemátodos e insectos y se manifiesta en el aumento de proteínas relacionadas con este proceso. Para entender el origen y la evolución de la apoptosis se habrían de tener más genomas seqüenciados de las diferentes ramas de la vida: cianobacterias, actinomicetos, eucariotas y cordados primitivos.

Proteína		BH1	BH2	BH3	BH4	TM
Bak 2 Humana		117-136	169-184	74- 88	-	188-205 (potencial)
Bak	Humana	117-136	169-184	74-88	-	188-205 (potencial)
	Ratón	114-133	166-181	71-85	-	185-202 (potencial)
BHRF1 Epstein-barr virus		89-109	142-157	-	-	166-186 (potencial)
Bax-a	Bovino	98-118	150-165	59-73	-	172-192 (potencial)
	Humano	98-118	150-165	59-73	-	172-192 (potencial)
	Rata	98-118	150-165	59-73	-	172-192 (potencial)
	Ratón	98-118	150-165	59-73	-	172-192 (potencial)
Bax-b Humano		98-118	150-165	59-73	-	-
Bax-d Humano		49-69	101-116	-	-	-
Bcl2	Bovino	126-145	177-192	83-97	10-30	202-223 (potencial)
	Hámster	133-152	184-199	90-104	10-30	209-230 (potencial)
	a Humano	136-155	187-202	93-107	10-30	212-233 (potencial)
	b humano	136-155	187-202	93-107	10-30		196-239 (potencial)
	Pollo	130-149	181-196	87-101	10-30	208-228 (potencial)
	Rata	133-152	184-199	90-104	10-30	209-230 (potencial)
	Ratón	133-154	184-199	90-104	10-30	209-230 (potencial)
Bcl-w	Humano	85-104	136-151	-	9-29
	Ratón	85-104	136-151	-	9-29	-
Bcl-x	Humano	129-148	180-195	86-100	4-24	210-226 (potencial)
	Pollo	125-144	176-191	82-96	4-24	206-223 (potencial)
	Cerdo	129-148	180-195	86-100	4-24	210-226 (potencial)
	Rata	129-148	180-195	86-100	4-24	210-226 (potencial)
	Ratón	129-148	180-195	86-100	4-24	210-226 (potencial)
Bfl-1 (A1)	Humano	77-97	132-147	-	-	-
	Ratón	77-97	132-147	-	-	-
Mcl-1 Humano		252-272	304-319	209-223	-	330-349 (potencial)
CED9 Caenorhabditis briggsae		159-179	213-228	-	80-99	-
CED9 Caenorhabditis elegans		160-179	213-229	-	80-99	-
Drob1 Drosophila melanogaster		-	-	presente	-	-
Lmh-5w African swine fever virus		76-95	126-141	-	-	1-18 (potencial)
BHP1 Geodia cydonium		presente	presente	-	-	-
BHP1 Suberites domuncula		presente	presente	-	-	-

Para realizar el estudio filogenético hemos escogido los homólogos que hemos considerado como más representativos. Hemos utilizado Bcl2 y Bclw tanto de humano como de ratón para saber si se han generado antes o después de la radiación de los vertebrados y Bfl1 como miembro lejano de la familia para saber si la familia entera ya existía antes o después del mismo período.

Como homólogos, se han utilizado: Drob1 procedente de Drosophila melanogaster (Zhang H. et al.), Ced9 de Caenorhabditis elegans (Cizeau J. et al.), Bhp1 de Geodia cydonium (esponja) (Wiens M. et al.) y Lmh-5w del virus africano de la fiebre porcina (Neilan JG et al.).

En algunas de les celdas de la tabla que hemos construido hemos escrito solo la palabra presente. Esto es debido a que no hemos encontrado la localización exacta de algunos de los dominios pero podemos confirmar su existencia gracias a la bibliografía utilizada.

Una vez escogidas las secuencias mediante Blast y otros artículos científicos ya citados en la bibliografía, hemos realizado el alineamiento múltiple con ClustalW y el resultado se ha utilizado para el análisis filogenético con el paquete de programas Phylip: protdist, neighbor-joining, seqboot y consense. Primero hemos construido un árbol con protdist y neighbor-joining para conocer las distancias evolutivas entre las diferentes proteínas de estos organismos. En un segundo paso hemos obtenido el árbol consenso a partir de las mil matrices de distancias que provienen de los mil alineamientos generados con seqboot. En la imagen vemos el árbol consenso donde constan las distancias filogenéticas obtenidas con el primer paso.

La agrupación de los miembros de Bcl2 y Bclw es la esperada porque los dos pertenecen a la subfamilia anti-apoptótica de vertebrados y conservan una alta homología. A priori, creíamos que los Bfl1 se dispondrían juntamente con los miembros anti-apoptóticos ya que pertenecen a la misma familia funcional, pero el hecho que no sea así puede explicarse porque solo comparten los dominios BH1 y BH2.

También observamos que BHP1 (G. cydonium) y LMH-5W (ASFV) se agrupan, aunque están a una distancia evolutiva considerable porque las dos sólo contienen los dominios BH1 y BH2.

Sobre les proteínas Ced9 y Drob1 no podemos explicar su disposición razonadamente: Ced9 contiene BH1, BH2 y BH4 y por tanto es una proteína anti-apoptótica y Drob1 sabemos que es pro-apoptótica y podemos asegurar que contendrá el dominio BH3 y posiblemente algún otro, aunque no hemos encontrado ningún tipo de descripción de dominios de esta proteína. Hay la posibilidad que la localización de éstas en el árbol sea principalmente causado por el efecto del azar. Este hecho lo explicamos en el siguiente punto.

El valor de bootstrap de las ramas de un árbol consense está relacionado con la robustez de éstas, es decir, con el grado en que el azar interviene en su disposición. En nuestro árbol, la parte que ya se ha comentado supera un valor de 910 (de 1000 árboles, 910 contienen aquella rama en la misma posición) por tanto podemos asegurar que el resultado es correcto y no hemos creído necesario especificarlo en el gráfico. El hecho de analizar organismos muy alejados filogenéticamente, conlleva a que algunas ramas tengan valores de robustez más bajos:

·; rama que une Bfl1 y Ced9 con el resto y la que une estas dos más Drob1 con el resto: tienen valores de 300 aproximadamente. Esto es debido a que la distancia entre C.elegans y D.melanogaster respecto al linaje vertebrado es considerable; aunque el conjunto de proteínas conserva una función homóloga, sus secuencias nucleotídicas pueden haberse diversificado mucho. Este hecho ha provocado un alineamento condicionado por el azar y unos valores de bootstrap bajos.

·; rama que une los Bcl2 (d’H.sapiens i M.musculus) y los BclW (d’H.sapiens i M.musculus) con el resto de secuencias: también tiene un valor de 441. Podría explicarse porque estas cuatro secuencias son las más homólogas de todo el grupo y un intento de alinearlas con secuencias más lejanas dificulta que queden relacionadas.

·; rama que relaciona las secuencias LMH-5W (African Swine Fever Virus) i BHP1 (G.cydonium) con el resto: valor muy cercano a 600. En este caso, pensamos que el motivo vuelve a ser la existencia de una gran distancia filogenética.

El hecho que las ramas que conectan los organismos más alejados filogenéticamente no sean muy robustas nos obliga a realizar más análisis para comprobar que realmente están relacionadas evolutivamente con esta familia y, si es así, determinar de qué miembro son homólogas.

Hemos buscado las secuencias proteicas en Swissprot de los homólogos de Bcl2 de Epstein-Barr virus (P03182), African Swine Fever virus (Q07818), Drosophila melanogaster (Q9V9C8) y Caenorhabditis elegans (P41958). Con cada una de estas secuencias hemos realizado un PSIBlast y de entre los resultados obtenidos se han buscado en qué proteínas homólogas de vertebrados se observan los scores más altos.

En el caso del virus africano de la peste porcina se observa una mayor homología con las proteínas Bclx de vertebrados, como por ejemplo el Bclx de Xenopus laevis con el mayor score (50) y el mínimo E-value (1e-05). Con valores muy parecidos encontramos los Bclx de Bos taurus, Sus scrofa y Mus musculus.

Por otra parte, los resultados obtenidos con Epstein-Barr virus no son concluyentes ya que los homólogos que encontramos de la familia Bcl2 en vertebrados tienen un E-value próximo a uno.

En el caso de C. Elegans este programa encuentra una alta homología (24%) entre la proteína Ced9 de este organismo y Bclw de vertebrados. Por ejemplo, con el valor más alto de score (53) y un E-value más bajo (3e-06) tenemos el Bclw de Rattus norvegicus, y lo siguen los Bclw de Mus musculus y Homo sapiens.

El último caso estudiado ha sido el de Drosophila melanogaster. Encontramos que contiene una homología de un 34% con BOK (de la subfamilia proapoptótica Bax) de Gallus gallus, con un score de 103 y un E-value 2e-21.

Como podemos observar los virus tienen homólogos en vertebrados anti-apoptóticos, el sentido evolutivo radicaría en el beneficio que obtienen al evitar la muerte celular de sus huéspedes. En cambio, en D.melanogaster hemos encontrado que la proteína Drob1 es en realidad un promotor de la apoptosis, esto podría explicar que la conexión de esta proteína al resto fuera dudosa y, por tanto, entenderíamos porqué el valor de bootstrap de esta rama es tan bajo.