ESTUDI GENÒMIC COMPUTACIONAL DE LA PROTEÏNA DE FUSIÓ AML1-MTG8



Clàudia Roca Herms i Alba Vega Molina


Universitat Pompeu Fabra.
Curs 2006-2007


ÍNDEX



  1. OBJECTIUS.

  2. RESUM.

  3. RESULTATS.

  4. MÈTODES.

  5. DISCUSSIÓ.

  6. REFERÈNCIES.



OBJECTIUS



RESUM


El nostre treball consisteix en l’estudi genòmic computacional de la proteïna de fusió AML1-MTG8 . Aquesta proteïna era la que presentava una identitat més alta i un evalue més baix després de realitzar un tBLASTn amb la seqüència aminoacídica assignada.
Aquesta proteïna es forma com a resultat de la translocació t(8;21) que és una de les translocacions més freqüents en la leucèmia mieloide aguda .
Aquesta translocació es produeix degut al trencament en un intró específic del gen AML1 al cromosoma 21. Aquest fragment del gen AML1 s’introdueix al costat del gen MTG8 al cromosoma 8 de manera que la pauta de lectura es manté i el resultat és un trànscrit de fusió AML1-MTG8 que en transcriure’s donarà lloc a la proteïna de fusió AML1-MTG8.
Al tractar-se d’una proteïna que tan sols és present en cas de malaltia per assolir els objectius del treball treballarem amb les dues proteïnes i els seus gens corresponents independentment però sempre que sigui possible s’intentarà comparar els resultats obtinguts amb la proteïna de fusió que és l’objectiu principal del treball.



RESULTATS


CARACTERITZACIÓ DE L’ESTRUCTURA GENÒMICA:

Dels resultats obtinguts després de realitzar un tBLASTn a partir de la seqüència peptídica assignada ens vam quedar amb el que presentava una identitat més elevada amb un Score més alt i un evalue més baix. Aquest resultat corresponia al transcrit de la proteïna de fusió AML1-MTG8.
Al tractar-se d’una proteína de fusió quan realitzavem aliniaments amb altres bases de dades només trobàvem dos fragments d’alta homologia amb la nostra seqüència que corresponien a les dues proteïnes que formen part de la proteïna de fusió independentment.
Aquest és el resultat obtingut després de realitzar un BLAT a la base de dades UCSC.

Veiem que aquest dos fragments amb alta identitat corresponen a les proteïnes MTG8 i AML1:

MRIPVDASTSRRFTPPSTALSPGKMSEALPLGAPDAGAALAGKLRSGDRSMVEVLADHPGELVRTDSPNF LCSVLPTHWRCNKTLPIAFKVVALGDVPDGTLVTVMAGNDENYSAELRNATAAMKNQVARFNDLRFVGRS GRGKSFTLTITVFTNPPQVATYHRAIKITVDGPREPRNRTEKHSTMPDSPVDVKTQSRLTPPTMPPPPTT QGAPRTSSFTPTTLTNGTSHSPTALNGAPSPPNGFSNGPSSSSSSSLANQQLPPACGARQLSKLKRFLTT LQQFGNDISPEIGERVRTLVLGLVNSTLTIEEFHSKLQEATNFPLRPFVIPFLKANLPLLQRELLHCARL AKQNPAQYLAQHEQLLLDASTTSPVDSSELLLDVNENGKRRTPDRTKENGFDREPLHSEHPSKRPCTISP GQRYSPNNGLSYQPNGLPHPTPPPPQHYRLDDMAIAHHYRDSYRHPSHRDLRDRNRPMGLHGTRQEEMID HRLTDREWAEEWKHLDHLLNCIMDMVEKTRRSLTVLRRCQEADREELNYWIRRYSDAEDLKKGGGSSSSH SRQQSPVNPDPVALDAHREFLHRPASGYVPEEIWKKAEEAVNEVKRQAMTELQKAVSEAERKAHDMITTE RAKMERTVAEAKRQAAEDALAVINQQEDSSESCWNCGRKASETCSGCNTARYCGSFCQHKDWEKHHHICG QTLQAQQQGDTPAVSSSVTPNSGAGSPMDTPPAATPRSTTPGTPSTIETTPR



Paral.lelament vam buscar informació en una segona base de dades: ensembl i els resultats van ser els mateixos: dos fragments d’alta homologia que corresponen a les dues proteïnes.

En aquest punt la cerca d’informació es farà per les dues proteïnes independentment.

AML1 ( RUNX1):

El gen que codifica per aquesta proteïna es troba localitzat al cromosoma 21.

Al cercar els trànscrits associats al gen ens vam adonar que les dues bases de dades (Ensembl i UCSC) ens aportaven informació diferent. Pel què fa a Ensembl vam trobar que tenia 5 trànscrits :

TRÀNSCRIT 1: ENT00000300305
Exons Inici Final Inici Fase Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 35,343,009 35,343,511 - 1 NO NO SÍ
2 35,187,092 35,187,130 1 1 SÍ NO NO
3 35,181,010 35,181,263 1 0 SÍ NO NO
4 35,174,724 35,174,880 0 1 SÍ NO NO
5 35,153,641 35,153,745 1 1 SÍ NO NO
6 35,128,577 35,128,768 1 1 SÍ NO NO
7 35,093,468 35,093,629 1 1 SÍ NO NO
8 35,081,975 35,086,777 1 - NO NO SÍ
TRÀNSCRIT 2: ENST00000325074
Exons Inici Final Inici Fase Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 35,183,844 35,183,904 0 1 SÍ NO NO
2 35,181,010 35,181,263 1 0 SÍ NO NO
3 35,174,724 35,174,880 0 1 SÍ NO NO
4 35,153,641 35,153,745 1 1 SÍ NO NO
5 35,128,577 35,128,768 1 1 SÍ NO NO
6 35,093,468 35,093,629 1 1 SÍ NO NO
7 35,081,975 35,086,777 1 - NO NO SÍ
TRÀNSCRIT 3: ENST00000342083
Exons Inici Final Inici Fase Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 35,181,010 35,182,857 - 0 NO NO SÍ
2 35,174,724 35,174,880 0 1 SÍ NO NO
3 35,153,641 35,153,745 1 1 SÍ NO NO
4 35,150,580 35,150,614 1 0 SÍ NO NO
TRÀNSCRIT 4: ENST00000344691
Exons Inici Final Inici Fase Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 35,181,010 35,182,857 - 0 NO NO SÍ
2 35,174,724 35,174,880 0 1 SÍ NO NO
3 35,153,641 35,153,745 1 1 SÍ NO NO
4 35,128,577 35,128,768 1 1 SÍ NO NO
5 35,093,468 35,093,629 1 1 SÍ NO NO
6 35,086,335 35,086,777 1 0 SÍ NO NO
7 35,086,318 35,086,330 0 1 SÍ NO NO
8 35,086,146 35,086,222 1 0 SÍ NO NO
TRÀNSCRIT 5: ENST00000358356
Exons Inici Final Inici Fase Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 35,181,010 35,182,857 - 0 NO NO SÍ
2 35,174,724 35,174,880 0 1 SÍ NO NO
3 35,153,641 35,153,745 1 1 SÍ NO NO
4 35,128,577 35,128,768 0 1 SÍ NO NO
5 35,115,444 35,115,863 1 - NO NO SÍ


Trànscrit 1 2 3 4 5
Info peptídica 480 aa 468 aa 188 aa 472 aa 250 aa

D’aquests tant sols els trànscrits 3, 4 i 5 poden formar part de la proteïna de fusió, les altres formes presenten exons diferents que no tenen la seqüència aminoacídica necessària per donar lloc a la proteïna de fusió.
A la base de dades UCSC vam trobar informació sobre els trànscrits Refseq. Per la proteïna AML1 vam obtenir 2 trànscrits Refseq:

TRÀNSCRIT 1: NM_001001890
Exons Inici Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 35181010 35182857 0 NO NO SÍ
2 35174724 35174880 0 SÍ NO NO
3 35153641 35153745 2 SÍ NO NO
4 35128577 35128768 2 SÍ NO NO
5 35093468 35093629 2 SÍ NO NO
6 35081969 35086777 2 NO NO SÍ
TRÀNSCRIT 2: NM_001754
Exons Inici Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 35343009 35343465 0 NO NO SÍ
2 35187092 35187130 2 SÍ NO NO
3 35181010 35181263 2 SÍ NO NO
4 35174724 35174880 0 SÍ NO NO
5 35153641 35153745 2 SÍ NO NO
6 35128577 35128768 2 NO NO SÍ
7 35093468 35093629 2 NO NO SÍ
8 35081969 35086777 2 SÍ NO NO


Trànscrit 1 2
Info peptídica 453 aa 480 aa

Finalment, vam decidir donar més confiança a les dades de Refseq ja que vam considerar que es tracta d’una bona base de dades; ben curada i basada més en anàlisi funcional que en prediccions, com seria el cas de l’Ensembl. A partir d’aquest punt els resultats es basaran en els trànscrits RefSeq.
Aquests resultats els vam obtenir amb l’opció Table Browser de la base de dades UCSC. D’aquesta forma podíem obtenir mitjançant l’indicador de cada trànscrit la longitud de la regió codificant de cada exó i el frame corresponent. Amb aquestes dades podem concloure que els dos tràncrits formen dues isoformes generades per splicing alternatiu. La diferència consisteix en què el segon trànscrit comença a transcriure dos exons abans. Els exons 1 i 2 del segon trànscrit no es troben en el primer. El 3r exó del segon trànscrit i el 1r exó del primer trànscrit no coincideixen. A partir del 4t exó del segon trànscrit i el 2n exó del primer trànscrit hi ha una correspondència exacte en longitud dels exons i de fase.

Finalment vam buscar quines isoformes protèiques trobàvem per les dues proteïnes, els resultats de la base de dades uniprot van ser els que es mostraran a continuació. A la vegada, vam intentar averiguar quines d’aquestes isoformes pertanyien als trànscrits obtinguts fins al moment:

ISOFORMES (UniProt) Correspondéncia amb tránscrits Ensembl Correspondéncia amb tránscrits RefSeq
Q01196 - TRÀNSCRIT 1:NM_001001890
AML1-1A TRÀNSCRIT 4:ENST00000344691 -
AML1-1C TRÀNSCRIT 5 : ENST00000358356 -
AML1-1E - -
AML1-1FA - -
AML1-1FB - -
AML1-1FC - -
AML1-1G - TRÀNSCRIT 2: NM_001754
AML1-1H - -
AML1-1I TRÀNSCRIT 2: ENST00000325074 -
AML1-1L - -

Amb totes aquestes dades podem arribar a la conclusió que el trànscrit de AML1 necessari per la formació de la proteína de fusió AML1-MTG8 és el primer trànscrit de Refseq i la isoforma resultant d’aquest és la primera de la base de dades Uniprot. I per tant a l’hora de caracteritzar el promotor ho farem amb la seqüència obtinguda d’aquest trànscrit.

MTG8 ( RUNX1T1):

El gen que codifica per aquesta proteïna es troba localitzat al cromosoma 8:

De nou, la informació obtinguda sobre els trànscrits en les dues bases de dades no coincidia. A la base de dades UCSC trobàvem 4 trànscrits mentre que amb l’Ensembl dos. Pel que fa a Ensembl :

TRÀNSCRIT 1: ENST00000265814
Exons Inici Final Inici Fase Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 93,157,369 93,157,540 - 1 NO NO SÍ
2 93,098,630 93,098,767 1 1 SÍ NO NO
3 93,095,983 93,096,224 1 0 SÍ NO NO
4 93,092,406 93,092,495 0 0 SÍ NO NO
5 93,086,520 93,086,701 0 2 SÍ NO NO
6 93,073,043 93,073,293 2 1 SÍ NO NO
7 93,068,291 93,068,376 1 0 SÍ NO NO
8 93,067,528 93,067,729 0 1 SÍ NO NO
9 93,057,309 93,057,377 1 1 SÍ NO NO
10 93,052,062 93,052,252 1 0 SÍ NO NO
11 93,040,328 93,041,921 0 - NO NO SÍ
TRÀNSCRIT 2: ENST00000360348
Exons Inici Final Inici Fase Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 93,176,432 93,176,619 - - NO SÍ NO
2 93,098,630 93,098,767 - 1 NO NO SÍ
3 93,095,983 93,096,224 1 0 SÍ NO NO
4 93,092,406 93,092,495 0 0 SÍ NO NO
5 93,086,520 93,086,701 0 2 SÍ NO NO
6 93,073,043 93,073,293 2 1 SÍ NO NO
7 93,068,291 93,068,376 1 0 SÍ NO NO
8 93,067,528 93,067,729 0 1 SÍ NO NO
9 93,057,309 93,057,377 1 1 SÍ NO NO
10 93,052,062 93,052,252 1 0 SÍ NO NO
11 93,040,328 93,041,921 0 - NO NO SÍ


Trànscrit 1 2
Info Peptídica 604 aa 567 aa

Aquests dos trànscrits coincideixen exactament ( mateixa seqüència, mateixa regió codificant, i la proteïna produïda conté mateix nombre i seqüència d’aminoàcids) amb dos dels quatre trànscrits RefSeq trobats a UCSC. Al comentar per tant, els trànscrits RefSeq se sobrentendrà que també s’estan comentant aquests.

Els resultats obtinguts al UCSC són:

TRÀNSCRIT 1: NM_175636
Exons Inici Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 93,098,630 93,099,084 0 NO NO SÍ
2 93,095,983 93,096,224 2 SÍ NO NO
3 93,092,406 93,092,495 0 SÍ NO NO
4 93,086,520 93,086,701 0 SÍ NO NO
5 93,073,043 93,073,293 1 SÍ NO NO
6 93,068,291 93,068,376 2 SÍ NO NO
7 93,067,528 93,067,729 0 SÍ NO NO
8 93,057,309 93,057,377 2 SÍ NO NO
9 93,052,062 93,052,252 2 SÍ NO NO
10 93,040,328 93,041,221 0 NO NO SÍ
TRÀNSCRIT 2: NM_004349
Exons Inici Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 93,143,950 93,144,367 0 NO NO SÍ
2 93,098,630 93,098,767 2 SÍ NO NO
3 93,095,983 93,096,224 2 SÍ NO NO
4 93,092,406 93,092,495 0 SÍ NO NO
5 93,086,520 93,086,701 0 SÍ NO NO
6 93,073,043 93,073,293 1 SÍ NO NO
7 93,068,291 93,068,376 2 SÍ NO NO
8 93,067,528 93,067,729 0 SÍ NO NO
9 93,057,309 93,057,377 2 SÍ NO NO
10 93,052,062 93,052,252 2 SÍ NO NO
11 93,040,328 93,041,921 0 NO NO SÍ
TRÀNSCRIT 3: NM_175634
Exons Inici Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 93,157,369 93,157,540 0 NO NO SÍ
2 93,098,630 93,098,767 2 SÍ NO NO
3 93,095,983 93,096,224 2 SÍ NO NO
4 93,092,406 93,092,495 0 SÍ NO NO
5 93,086,520 93,086,701 0 SÍ NO NO
6 93,073,043 93,073,293 1 SÍ NO NO
7 93,068,291 93,068,376 2 SÍ NO NO
8 93,067,528 93,067,729 0 SÍ NO NO
9 93,057,309 93,057,377 2 SÍ NO NO
10 93,052,062 93,052,252 2 SÍ NO NO
11 93,040,328 93,041,921 0 NO NO SÍ
TRÀNSCRIT 4: NM_175635
Exons Inici Final Fase Codificant No Codificant Híbrid
1 93,176,432 93,176,619 - NO SÍ NO
2 93,098,630 93,098,767 0 SÍ NO NO
3 93,095,983 93,096,224 2 SÍ NO NO
4 93,092,406 93,092,495 0 SÍ NO NO
5 93,086,520 93,086,701 0 SÍ NO NO
6 93,073,043 93,073,293 1 SÍ NO NO
7 93,068,291 93,068,376 2 SÍ NO NO
8 93,067,528 93,067,729 0 SÍ NO NO
9 93,057,309 93,057,377 2 SÍ NO NO
10 93,052,062 93,052,252 2 SÍ NO NO
11 93,040,328 93,041,921 0 NO NO SÍ


Trànscrit 1 2 3 4
Info Peptídica 567 aa 577 aa 604 aa 567 aa

Els trànscrits 3 i 4 de RefSeq corresponen als trànscrits 1 i 2 de Ensembl respectivament.
El trànscrit 1 és el que difereix més de la resta: primerament presenta un exó menys i la longitud dels exons no coincideix amb cap de les longituds dels exons dels altres tres trànscrits. Els altres tres trànscrits s’assemblen més entre ells, ja que presenten el mateix número d’exons amb les mateixes coordeenades amb l’excepció del primer exó que és diferent en els tres casos. Però tots tres presenten diferències en el primer exó : són tots diferents en longitud i part codificant (CDS). Concretament, en l’últim trànscrit, tot el primer exó és no codificant. Finalment, observem que aquests trànscrits donen lloc a seqüències aminoacídiques diferents.
Amb aquests resultats podem concloure que aquests tres trànscrits donen lloc a diferents isoformes produïdes per splicing alternatiu que afecta en tots els casos a la regió codificant i per tant donen lloc a diferents pèptids.

Tant sols dos dels quatre trànscrits poden formar part de la proteïna de fusió, el 2 i el 3, ja que la resta no presenten tots el aminioàcids presents a la proteïna de fusió.
Posteriorment, vam buscar les isoformes a través d’Uniprot. El resultat van ser dues isoformes MTG8-A I MTG8-B que coincidien exactament amb la seqüència peptídica predita a paritir dels trànscrit Refseq 2 i 3 respectivament.

ISOFORMES (UniProt) Correspondéncia amb tránscrits
MTG8-A NM_004349
MTG8-B NM_175634



HOMOLOGIA AMB ALTRES ESPÈCIES:

Homogia de AML1 amb altres espècies per ordre decreixent de percentatge d’identitat:

IMATGE ESPÈCIE GEN TIPUS D’HOMOLOGIA QUERY % ID
Pan troglodytes ENSPTRG00000013883 1-to-1 100
Macaca mulatta ENSMMUUG00000001649 1-to-1 99
Bos taurus ENSBTAG0000004742 1-to-1 98
Oryctolagus cuniculus ENSOCUG00000013731 1-to-1 93
Canis familiaris ENSCAFG00000009596 1-to-1 92
Mus musculus ENSMUSG00000022952 1-to-1 89
Rattus norvegicus ENSRNOG00000001704 1-to-1 88
Echinops telfairi ENSETEG00000011313 1-to-1 86
Monodelphis domestica ENSMODG00000021051 1-to-1 85
Xenopus tropicalis ENSXETG00000014140 1-to-1 82
Tupaia belangeri ENSTBEG00000000192 1-to-1 74
Gallus gallus ENSGALG00000016022 1-to-1 66
Felis catus ENSFCAG00000006761 1-to-1 65
Cavia porcellus ENSCPOG00000002684 1-to-1 62
Takifugu rubripes SINFRUG00000149207 1-to-1 57
Orycias latipes ENSORLG00000020699 1-to-1 55
Gasterostus aculeatus ENSGACG00000015276 1-to-1 49
Loxodonta africana ENSLAFG00000004290 1-to-1 47
Dasypus novemcintus ENSDNOG00000015041 1-to-1 46
Tetraodon nigroviridis GSTENG00034595001 1-to-1 34
Drosophila melanogaster CDG1689 many to many 30
Drosophila melanogaster CG1849 many to many 27
Aedes aegypti AAEL006167 many to many 26
Ciona intestinalis ENSCING00000002253 1-to-many 24
Drosophila melanogaster CG1379 many to many 24
Ciona savignyi ENSCSAVG00000004072 1-to-many 22
Drosophila melanogaster CG15455 many to many 22
Aedes aegypti AAEL006160 many to many 21
Anopheles gambiae ENSANGG00000011627 many to many 20
Aedes aegypti AAEL007040 many to many 19
Anopheles gambiae ENSANGG00000019555 many to many 19
Caernorhabditis elegans B0414.2 1-to-many 18
Aedes aegypti AAEL007036 many to many 16
Ornithorhynchus anatinus ENSOANG00000011162 1-to-1 12

Els resultats obtinguts mostren que tant sols troben alta homologia d’aquesta proteïna en altres espècies quan aquestes són molt properes filogenèticament. A mesura que ens allunyem en l’escala filogenètica els percentatges d’identitat disminueixen.

Homologia de MTG8 amb altres espècies per ordre decreixent de percentatge d’identitat:

IMATGE ESPÈCIE GEN TIPUS D’HOMOLOGIA QUERY % ID
Pan troglodytes ENSPTRG00000013883 1-to-1 100
Macaca mulatta ENSMMUUG000000023115 1-to-1 99
Tupaia belangeri ENSTBEG00000010312 1-to-1 98
Gallus gallus ENSGALG00000015926 1-to-1 97
Bos taurus ENSBTAG00000017339 1-to-1 94
Oryctolagus cuniculus ENSOCUG00000013731 1-to-1 93
Mus musculus ENSMUSG0000006586 1-to-1 94
Rattus norvegicus ENSRNOG00000005673 1-to-1 94
Canis familiaris ENSCAFG00000009078 1-to-1 92
Monodelphis domestica ENSMODG0000007500 1-to-1 92
Ornithorhynchus anatinus ENSOANG00000001913 1-to-1 92
Xenopus tropicalis ENSXETG00000014592 1-to-1 92
Danio rerio ENSDARG00000003680 1-to-1 87
Felis catus ENSFCAG00000005350 1-to-1 85
Gasterostus aculeatus ENSGACG00000005059 1-to-1 84
Loxodonta africana ENSLAFG00000005779 1-to-1 84
Orycias latipes ENSORLG00000012311 1-to-1 80
Takifugu rubripes SINFRUG00000133596 1-to-1 80
Tetraodon nigroviridis GSTENG00017458001 1-to-1 80
Echinops telfairi ENSETEG00000014837 1-to-1 75
Dasypus novemcintus ENSDNOG00000008847 1-to-1 51
Aedes aegypti AAEL003615 many to many 26
Aedes aegypti AAEL014203 many to many 26
Anopheles gambiae ENSANGG00000015731 1 to many 26
Drosophila melanogaster CDG3385 1 to many 24

Els resultats obtinguts mostren una identitat molt alta entre aquesta proteïnes i les seves homòlogues en altres espècies. El percentatge d’identitat és molt alt fins i tot en espècies bastant separades en l’escala filogenètica. No és fins que ens allunyem molt que la identitat disminueix considerablement, es tracta per tant d’una proteïna molt conservada.

Els resultats obtinguts per les dues proteïnes independentment amb l’ensembl coincideixen amb els resultats de que podem observar realitzant un tblastn amb la seqüència de la proteïna de fusió contra tots els genomes i posteriorment mirar els resultats de taxonomy report. Veiem que les espècies que presenten regions homòlogues a la proteïna de fusió són les mateixes que en l’ensembl es mostren com a ortòlogues de cada proteïna per separat en diferents espècies.



CARACTERITZACIÓ DE L’EXPRESSIÓ DEL GEN:

Per tal de caracteritzar l’expressió del gen vam buscar informació al gene Atlas 2 a través de la base de dades UCSC. Aquest track el podem trobar al Genome Browser i ens mostra els resultats d’un anàlisi d’expressió que consisteix en dos rèpliques de 79 teixits humans que s’analitzen a través de microarrays. Com tot els resultats basats en microarrays, el color vermell indica sobreexpressió mentre que el verd indica expressió inferior a la normal (mirar llegenda):


Els resultats obtinguts van ser:



TEIXIT AML1 MTG8
Cervell abscent present
Càncer present absent
Germinals abscent abscent
Glàndules abscent abscent
Sist.immune present abscent
Múscul abscent present
Sist.nerviós abscent abscent





No hem obtingut informació de l’expressió sobre la proteïna de fusió però si de les dues proteïnes AML1 i MTG8 per separat:
Els següents resultats mostren una sopreexpressió de AML1 en teixit cancerós i en sistema immunitari però no s’observa expressió en els altres teixits. Pel que fa a MTG8 tant sols observem sobreexpressió en múscul i en cervell.
Aquests resultats coincideixen amb els que esperàvem a partir de la informació proporcionada per l’article : The t(8;21) translocation in acute myeloid leucemia results in production of an AML1-MTG8 fusion transcript. En aquest article confirmaven l’expressió de AML1 en cèl.lules hematopoiètiques i la seva funció com a factor de transcripció essencial per la diferenciació i creixement de les diferents línies cel.lulars hematopoiètiques. En canvi, l’expressió de MTG8 va ser detectada en alts nivells en el cervell i en nivells més baixos en múscul. Però sorprenentment no es va detectar en òrgans hematopoiètics. Segons aquest article, la proteïna de fusió que resulta de la translocació t(8;21) s’expressa en cèl.lules hematopoiètiques igual que AML1, per tant la porció de MTG8 que trobem a la proteïna de fusió si que s’expressa en cèl.lules hematopoiètiques. Finalment amb aquests resultats i el fet que aquesta proteïna de fusió provoqui el desenvolupament de leucèmia mieloide els va portar a hipotetitzar que aquesta translocació provoca una mutació amb efecte dominant negatiu sobre AML1, i per tant aquesta perd el seu control en diferenciació i creixement sobre cèl.lules hematopoiètiques.
L’única discordància que trobem en els resultats de Gene Atlas 2 és que no troba expressió de MTG8 en càncer. Creiem que aquest fet es pot deure a que tan sols part de la proteïna de fusió està formada per MTG8 i per tant aquesta pot passar desepercebuda en un analisis d’expressió amb microarrays, és molt improbable que la sonda hibridi exactament amb aquest petit fragment.



CARACTERITZACIÓ DE LA REGIÓ PROMOTORA DEL GEN:

Per tal de caracteritzar la regió promotora primerament hem d’obtenir la regió promotora de tots els trànscrits que puguin formar part de la proteïna de fusió. Considerarem regió promotora 1000pb upstream del lloc de començament de la transcripció i 100pb downstream. Aquesta regió l’hem extret de la base de dades UCSC a través de l’opció del table browser. Les seqüències obtingudes estan en format fasta i hi podeu accedir amb els següents links:

AML1.fa

MTG8A.fa

MTG8B.fa

Un cop obtinguda la seqüència promotora intentarem predir quins possibles factors de transcripció s’uneixen a la nostra seqüència. Per aconseguir-ho realitzarem aquestes prediccions de dues formes diferents: La primera a través d’un programa disponible a la xarxa anomenat PROMO i la segona a partir d’un programa elaborat per nosaltres mateixes en Perl. Un cop obtinguem ambdues prediccions intentarem comparar-ne els resultats.

Teòricament aquests resultats són comparables ja que la idea en la que es basen per trobar aquestes prediccions és similar: els dos parteixen de les mateixes matrius d’ocurrència ( tot i que el nostre programa disposa només de 13 d’aquestes matrius). A partir d’aquestes matrius s’elaboren matrius de pesos a partir de les quals podem estimar la puntuació dels diferents motius que es puguin trobar en la regió promotora. En els dos casos obtenim valors de referència per comparar els resultats obtinguts amb la nostra seqüència promotora amb resultats que podriem obtenir amb seqüències generades a l’atzar.

Per obtenir resultats amb el programa PROMO hem seleccionat que només busques factors humans i només motius d’unió humans. Posteriorment hem introduït la seqüència promotora on voliem identificar llocs d’unió de factors de transcripció i vam limitar la cerca per aquells motius que presentessin un índex de dissimilaritat igual o inferior al 15%. De tots els resultats obtinguts ens vam quedar amb aquells que presentessin un RE equally (a l’atzar en una seqüència que presenti una composició de núcleotids equiprobable quants cops trobariem aquest motiu en concret) menor a 0,09. Vam considerar que era suficientment baix com per discriminar aquelles cerques que no són significatives, és a dir, que es podien donar perfectament per atzar. Després de tots aquests filtres els resultats obtinguts van ser els següents:



RESULTATS PROMO AML1
FACTOR DE TRANSCRIPCIÓ POSICIÓ INCIAL POSICIÓ INCIAL SEQÜÈNCIA RE EQUALLY RE QUERY
WT1 [T00899] 828 836 GCGGGGGCG 0,0042 0,13526
Sp1 [T00759] 48 57 GGGGCGGGGA 0,0042 0,13841
Sp1 [T00759] 465 474 CCCCCGCCCT 0,00734 0,1902
Sp1 [T00759] 729 738 CGGGCGGGGC 0,00734 0,1902
AhR:Arnt [T05394] 724 733 GCACGCGGGC 0,00944 0,12448
NF-AT1 [T01948] 978 987 TTCATTTCCA 0,01049 0,00198
EBF [T05427] 469 479 CGCCCTGGAAG 0,01049 0,07001
EBF [T05427] 489 499 GGCCCTGGGCG 0,01364 0,07945
ETF [T00270] 728 738 GCGGGCGGGGC 0,01574 0,43859
ETF [T00270] 825 835 GCGGCGGGGGC 0,01574 0,43859
E2F-1 [T01542] 292 299 GCGGTAAA 0,01678 0,00632
GCF [T00320] 503 511 GCGCAGGAT 0,01678 0,04782
GCF [T00320] 1070 1078 GCCCTGCGC 0,01678 0,13062
Sp1 [T00759] 789 798 TCCCCGCCCG 0,01783 0,30133
NF-kappaB1 [T00593] 89 99 GGGGAGACGCG 0,0181 0,0645
NF-kappaB1 [T00593] 432 442 AGTGGCTCCCC 0,0181 0,0645
Sp1 [T00759] 911 920 CGGCCGCCCC 0,01888 0,31353
Sp1 [T00759] 1017 1026 CGGGCGGGAC 0,01993 0,28742
STAT5A [T04683] 308 320 ATTACAGAAACCG 0,02095 0,00143
NF-AT2 [T01945] 218 227 GGAAACTCTT 0,02098 0,00185
NF-AT1 [T00550] 650 658 TCTTTTTCC 0,02098 0,00535
CTF [T00174] 840 851 GGGCCAATTCCA 0,02124 0,01069
CTF [T00174] 898 909 TGTGATTGGCCG 0,0236 0,01952
EBF [T05427] 1069 1079 GGCCCTGCGCC 0,02623 0,1144
AhR:Arnt [T05394] 349 358 GCACGCGCGG 0,02832 0,21419
PPAR-alpha:RXR-alpha [T05221] 25 35 ACCTGGGGCCG 0,02832 0,16829
PPAR-alpha:RXR-alpha [T05221] 510 520 ATCTGGGGCCG 0,02832 0,16829
NF-AT1 [T00550] 218 226 GGAAACTCT 0,02937 0,00628
NF-AT2 [T01945] 202 211 GGGTCTTTCC 0,03777 0,00738
NF-AT2 [T01945] 649 658 TTCTTTTTCC 0,03777 0,00738
NF-AT2 [T01945] 1087 1096 ACTTCTTTCC 0,03777 0,00738
NF-AT1 [T00550] 1088 1096 CTTCTTTCC 0,03777 0,00852
RAR-beta:RXR-alpha [T05420] 438 449 TCCCCCGGGCCC 0,03836 0,13369
ETF [T00270] 60 70 GGAGCGGGGGC 0,03934 0,79684
ETF [T00270] 446 456 GCCCCGCGGCC 0,03934 0,79684
ETF [T00270] 580 590 GCTCGCGGGGC 0,03934 0,79684
ETF [T00270] 1031 1041 GCCCCGCGGCC 0,03934 0,79684
c-Ets-2 [T00113] 947 955 TTCCTCCGG 0,04196 0,03749
NF-AT1 [T01948] 650 659 TCTTTTTCCA 0,04196 0,00692
EBF [T05427] 873 883 CGCCCTGGCTG 0,04406 0,15258
EBF [T05427] 1047 1057 CAGCCAGGGCA 0,04406 0,15258
PPAR-alpha:RXR-alpha [T05221] 1041 1051 CGGACCCAGCC 0,04721 0,29215
Sp1 [T00759] 494 503 TGGGCGGCCG 0,0493 0,41348
GCF [T00320] 131 139 TGCCGGCGC 0,05035 0,84673
GCF [T00320] 611 619 GCGCCGGCC 0,05035 0,84673
GCF [T00320] 836 844 GCGCGGGCC 0,05035 0,84673
GATA-2 [T00308] 882 890 TGATACCGG 0,05035 0,02422
NF-AT2 [T01945] 977 986 GTTCATTTCC 0,05875 0,01279
NF-AT2 [T01945] 173 182 TCAACTTTCC 0,06294 0,01491
c-Ets-1 [T00112] 216 222 TAGGAAA 0,06714 0,00633
ENKTF-1 [T00255] 1076 1083 CGCCGCCA 0,06714 0,35848
NF-1 [T00539] 839 846 CGGGCCAA 0,06714 0,12852
HIF-1 [T01609] 970 978 AAAGCACGT 0,07133 0,05854
STAT1beta [T01573] 885 894 TACCGGAAAG 0,08183 0,0313
ETF [T00270] 23 33 GCACCTGGGGC 0,08261 1,15588
ETF [T00270] 633 643 GCCGGCGGGGC 0,08261 1,15588
ETF [T00270] 735 745 GGGCCCCGGGC 0,08261 1,15588
ETF [T00270] 760 770 GGATGCGGGGC 0,08261 1,15588
E2F-1 [T01542] 1020 1027 GCGGGACG 0,08392 0,33331
USF2 [T00878] 20 29 TCCGCACCTG 0,08497 0,107
STAT1beta [T01573] 981 990 ATTTCCAGGC 0,08497 0,02097
AhR:Arnt [T05394] 696 705 GCCTGCGTGT 0,08497 0,21318
AhR:Arnt [T05394] 1058 1067 CCACGCTGCC 0,08497 0,21318
c-Ets-2 [T00113] 375 383 TGCAAGGAA 0,08812 0,01036


RESULTATS PROMO MTG8A
FACTOR DE TRANSCRIPCIÓ POSICIÓ INCIAL POSICIÓ INCIAL SEQÜÈNCIA RE EQUALLY RE QUERY
RBP-Jkappa 460 471 TTCATGGGAAGG 0 0
HOXD9 [T01424] 663 672 AATAAAAGTG 0 0,01
HOXD10 [T01425] 663 672 AATAAAAGTG 0 0,01
POU2F2 (Oct-2,1) [T00646] 857 867 TTTTTAATACA 0 0,01
NF-AT2 [T01945] 177 186 GGAAAGATTT 0 0,01
HOXD9 [T01424] 908 917 GCCTTTTATT 0,01 0,01
HOXD10 [T01425] 908 917 GCCTTTTATT 0,01 0,01
HNF-4alpha [T03828] 779 791 CAAAGTCTTATAA 0,01 0,01
POU2F2 (Oct-2,1) [T00646] 310 320 TGTTTTACAAA 0,01 0,03
AhR:Arnt [T05394] 279 288 GCAGGCGTGT 0,01 0
SRF [T00764] 906 918 AAGCCTTTTATTG 0,01 0,01
NF-AT1 [T00550] 177 185 GGAAAGATT 0,01 0,02
HNF-4alpha [T03828] 739 751 TTCTGATACTTTG 0,01 0,02
EBF [T05427] 634 644 ATCCCAGGGGG 0,01 0
RBP-Jkappa [T01616] 867 878 AGTTCCCAATTA 0,02 0,02
SRY [T00997] 373 381 ATAACAAAG 0,02 0,02
TBP [T00794] 391 400 TTTATATATC 0,02 0,05
HNF-1C [T01951] 456 464 GTTATTCAT 0,03 0,05
TCF-4 [T02918] 834 843 GCTTTGAGTT 0,03 0,02
NF-AT1 [T01948] 111 120 TGGAAAGGTA 0,03 0,04
c-Ets-2 [T00113] 727 735 CAAAAGGAA 0,03 0,06
SRY [T00997] 775 783 TATACAAAG 0,03 0,05
Elk-1 [T00250] 421 429 ATAGGGAAG 0,03 0,05
HOXD9 [T01424] 452 461 ATGTGTTATT 0,04 0,13
HOXD10 [T01425] 452 461 ATGTGTTATT 0,04 0,13
EBF [T05427] 63 73 GACCCTGAGTG 0,04 0,02
NF-AT2 [T01945] 593 602 GGAAAGTAAG 0,04 0,06
MEF-2A [T01005] 341 351 AGAAGAAAATA 0,04 0,1
MEF-2A [T01005] 656 666 CGAGTAAAATA 0,04 0,1
IRF-1 [T00423] 229 237 TTTCCTTCT 0,04 0,07
NF-AT2 [T01945] 112 121 GGAAAGGTAA 0,04 0,05
NF-AT1 [T01948] 811 820 GGGATTTCCA 0,04 0,06
T3R-beta1 [T00851] 994 1002 TGGTGGTGA 0,04 0,04
PEA3 [T00685] 755 763 AGGATGATA 0,05 0,07
GATA-2 [T00308] 361 369 AGATAAAGC 0,05 0,06
HNF-1C [T01951] 971 979 GTTAACCTT 0,06 0,09
AR [T00040] 512 520 GGACATGAT 0,06 0,04
NF-AT1 [T00550] 811 819 GGGATTTCC 0,06 0,06
NF-AT2 [T01945] 224 233 AGTATTTTCC 0,06 0,07
HNF-1B [T01950] 455 463 TGTTATTCA 0,06 0,11
MEF-2A [T01005] 699 709 TATTTTACACA 0,07 0,15
RXR-alpha [T01345] 623 629 TCAACCC 0,07 0,07
PR B [T00696] 691 697 AAGTGTT 0,07 0,11
PR A [T01661] 691 697 AAGTGTT 0,07 0,11
c-Myb [T00137] 763 770 AAACTGGC 0,07 0,06
c-Ets-1 [T00112] 175 181 TAGGAAA 0,07 0,11
SRY [T00997] 313 321 TTTACAAAG 0,07 0,09
PXR-1:RXR-alpha [T05671] 437 444 TGAACCTG 0,07 0,04
PXR-1:RXR-alpha [T05671] 519 526 ATTGTTCA 0,07 0,1
LEF-1 [T02905] 835 842 CTTTGAGT 0,07 0,1
TBP [T00794] 783 792 GTCTTATAAA 0,07 0,19
Elk-1 [T00250] 462 470 CATGGGAAG 0,07 0,07
IRF-1 [T00423] 108 116 CGATGGAAA 0,07 0,08
IRF-1 [T00423] 589 597 TAGAGGAAA 0,07 0,09
IRF-1 [T00423] 815 823 TTTCCAGTT 0,07 0,1
NF-AT1 [T00550] 225 233 GTATTTTCC 0,07 0,07
RAR-beta [T00721] 621 630 TATCAACCCG 0,08 0,07
RAR-beta [T00721] 968 977 AGGGTTAACC 0,08 0,07
PPAR-alpha:RXR-alpha [T05221] 764 774 AACTGGCACAA 0,08 0,05


RESULTATS PROMO MTG8B
FACTOR DE TRANSCRIPCIÓ POSICIÓ INCIAL POSICIÓ INCIAL SEQÜÈNCIA RE EQUALLY RE QUERY
ELF-1 [T01113] 67 79 TTCTAGGAAGTAA 0 0
POU2F2 (Oct-2,1) [T00646] 484 494 TGTTTTAAACT 0 0,04
IRF-1 [T00423] 976 984 TTTCCCTTT 0 0,01
PPAR-alpha:RXR-alpha [T05221] 1033 1043 CTGTCCCAGTC 0,01 0
c-Ets-2 [T00113] 343 351 TAGCAGGAA 0,01 0,01
NF-AT2 [T01945] 201 210 TTATATTTCC 0,01 0,02
MEF-2A [T01005] 86 96 CTCAAAAAATA 0,01 0,07
MEF-2A [T01005] 661 671 TATTTTTTTGA 0,01 0,07
HOXD9 [T01424] 198 207 CCCTTATATT 0,01 0,03
HOXD9 [T01424] 361 370 AATTTATATT 0,01 0,22
HOXD10 [T01425] 198 207 CCCTTATATT 0,01 0,03
HOXD10 [T01425] 361 370 AATTTATATT 0,01 0,22
MEF-2A [T01005] 657 667 TATTTATTTTT 0,01 0,16
PU,1 [T02068] 67 79 TTCTAGGAAGTAA 0,02 0,01
HOXD9 [T01424] 28 37 TTGTTTTATT 0,02 0,29
HOXD10 [T01425] 28 37 TTGTTTTATT 0,02 0,29
SRF [T00764] 169 181 CTACCTTATATGT 0,02 0,02
NF-AT1 [T01948] 784 793 TGGAAAATTA 0,02 0,04
MEF-2A [T01005] 299 309 GACAATAAATA 0,02 0,17
MEF-2A [T01005] 426 436 TATTTGTTTCA 0,02 0,17
NF-AT2 [T01945] 785 794 GGAAAATTAA 0,03 0,03
HNF-1B [T01950] 444 452 TTTTTAACT 0,03 0,11
ELF-1 [T01113] 203 215 ATATTTCCTAGTT 0,03 0,02
TCF-4 [T02918] 767 776 GCTTTGAGTC 0,03 0,01
STAT1beta [T01573] 205 214 ATTTCCTAGT 0,03 0,03
NF-AT1 [T00550] 348 356 GGAAAAATG 0,03 0,05
NF-AT1 [T00550] 972 980 TTTTTTTCC 0,03 0,05
HNF-1C [T01951] 443 451 TTTTTTAAC 0,03 0,11
HOXD9 [T01424] 93 102 AATAATAGCT 0,03 0,13
HOXD10 [T01425] 93 102 AATAATAGCT 0,03 0,13
STAT5A [T04683] 63 75 TAATTTCTAGGAA 0,03 0,1
c-Ets-2 [T00113] 116 124 TTCCTTTTG 0,03 0,08
c-Fos [T00123] 772 781 GAGTCAGATG 0,03 0,01
SRY [T00997] 565 573 CTTTGTTTT 0,03 0,06
SRY [T00997] 981 989 CTTTGTTGT 0,03 0,06
POU2F1 [T00641] 35 45 ATTTACATCAG 0,04 0,03
HOXD9 [T01424] 607 616 AATAATAATG 0,04 0,25
HOXD10 [T01425] 607 616 AATAATAATG 0,04 0,25
Elk-1 [T00250] 374 382 AAAAGGAAG 0,04 0,03
NF-AT2 [T01945] 348 357 GGAAAAATGA 0,05 0,08
NF-AT2 [T01945 971 980 TTTTTTTTCC 0,05 0,08
c-Ets-2 [T00113] 815 823 TGATAGGAA 0,05 0,08
Elk-1 [T00250] 68 76 TCTAGGAAG 0,05 0,05
HNF-1C [T01951] 680 688 AAATGTAAC 0,05 0,14
LEF-1 [T02905] 981 988 CTTTGTTG 0,05 0,04
AP-1 [T00029] 769 777 TTTGAGTCA 0,05 0,04
POU2F1 [T00641] 964 974 ATATGCATTTT 0,06 0,27
VDR [T00885] 1017 1025 CTGGTGAAC 0,06 0,02
NF-AT2 [T01945] 1057 1066 GGAAATTAGC 0,06 0,06
AR [T00040] 1030 1038 TCTCTGTCC 0,06 0,01
MEF-2A [T01005] 600 610 TTCCATAAATA 0,07 0,32
c-Ets-1 [T00112] 206 212 TTTCCTA 0,07 0,13
c-Jun [T00133] 771 777 TGAGTCA 0,07 0,05
c-Jun [T00133] 1038 1044 CCAGTCA 0,07 0,02
LEF-1 [T02905] 768 775 CTTTGAGT 0,07 0,13
c-Myb [T00137] 905 912 AAACTGGC 0,07 0,03
NF-Y [T00150] 721 728 AAACCAAT 0,07 0,08
IRF-1 [T00423] 781 789 GATTGGAAA 0,07 0,07
IRF-1 [T00423] 1053 1061 GAGAGGAAA 0,07 0,07
T3R-beta1 [T00851] 747 755 TCAGGGTGA 0,08 0,03
c-Ets-2 [T00113] 166 174 TTCCTACCT 0,08 0,03
NF-AT1 [T00550] 202 210 TATATTTCC 0,08 0,14
NF-AT1 [T00550] 785 793 GGAAAATTA 0,08 0,14
PPAR-alpha:RXR-alpha [T05221] 822 832 AACTGAGACAA 0,08 0,03


La segona metodologia utilitzada per resoldre el problema es basa en el programa en Perl elaborat per nosaltres mateixes i el fitxer de les 13 matrius que ja sen’s proporcionava en les instruccions del treball. Aquest dos documents hi podeu accedir a través dels següents links:

PROGRAMA

MATRIUS

Dels resultats obtinguts vam seleccionar aquells que presentaven puntuacions positives i dels resultants ens vam quedar tant sols amb aquells que presentaven un p-value inferior a 0,2. A l’hora d’avaluar els resultats obtinguts hem de tenir present que es tracta d’una gran simplificació del mètode utilitzat anteriorment i per tant és important saber que el programa PROMO serà molt més sensible, per exemple pot tenir en compte canvis que es poden donar a la matriu. També recordar que el p-value que obtenim amb el nostre programa es basa en una permutació a l’atzar de la nostra seqüència que té lloc 100 vegades per tant cada vegada que executem el programa obtindrem p-values diferents. Després d’executar el programa vàries vegades vam arribar a la conclusió que p-values inferiors a 0,2 podrien ser acceptats com a valors relativament significatius en la nostra aproximació.

Els resultats obtinguts van ser els següents ( amb negre mostrem els resultats que considerem significatius i en gris aquells que presenten puntuacions positives però p-values més alts de 0,2):



RESULTATS PROGRAMA PERL AML1
FACTOR DE TRANSCRIPCIÓ PUNTUACIÓ INICI FINAL SEQÜÈNCIA pVALUE
FA NF-AT1 [T00550] 2,9174 713 719 ggaaagg 0.18
FA YY1 [T00915] 2,6893 942 947 atggaa 0,65
FA HIF-1 [T01609] 3,8836 971 979 aaagcacgt 0,02
FA AhR [T01795] 2,8983 701 707 gcgtgtg 0,44
FA PU.1 [T02068] 3,1481 379 385 aaggaat 0,28


RESULTATS PROGRAMA PERL MTG8A
FACTOR DE TRANSCRIPCIÓ PUNTUACIÓ INICI FINAL SEQÜÈNCIA pVALUE
FA AR [T00040] 2,8661 981 987 gaacagg 0,34
FA NF-AT1 [T00550] 2,9573 178 184 ggaaaga 0,44
FA SRF [T00764] 3,4952 874 882 caattatgg 0,06
FA YY1 [T00915] 2,4594 879 884 atggct 0,55
FA RXR-alpha [T01345] 3,3085 438 443 tgaacc 0,08
FA AhR [T01795] 3,2154 284 290 gcgtgtg 0,16
FA PU.1 [T02068] 2,4176 501 507 caggaat 0,58


RESULTATS PROGRAMA PERL MTG8B
FACTOR DE TRANSCRIPCIÓ PUNTUACIÓ INICI FINAL SEQÜÈNCIA pVALUE
FA AP-1 [T00029] 4,0233 772 778 tgagtca 0,06
FA AR [T00040] 3,5576 529 535 gaacagc 0
FA NF-AT1 [T00550] 3,2255 349 355 ggaaaaa 0,11
FA YY1 [T00915] 2,584 833 838 atgggg 0,6
FA RXR-alpha [T01345] 2,162 554 559 tgaaac 0,73
FA PU.1 [T02068] 2,9479 292 298 gaggaat 0,18
FA HNF-4 [T02758] 4,434 195 202 tggaccct 0


Si comparem els resultats obtinguts amb el programa PROMO i el programa perl veiem que alguns dels factors de transcripció es repeteixen: en el cas de la proteïna AML1 l’únic resultat que comparteixen les dues solucions és el factor de transcripció NF-AT1. En el cas de MTG8A trobem dos resultats comuns: NA-SFR i RXR-alpha. Pel què fa a MTG8B en trobem 4: AP-1, AR, NF_AT1, PU.1 i HNF-4.

Però quan mirem aquests resultats en més detall ens adonem que les posicions en la seqüència promotora on el PROMO troba els motius d’unió d’aquests factors no coincideixen amb les obtingudes amb el nostre programa ni en longitud ni en composició de núcleotids. Finalment ens vam adonar que les matrius que utilitzem en el nostre programa no coincideixen amb les matrius del programa PROMO i és per aquest motiu que no podem comparar els resultats.



ESTUDI DE LA FUNCIÓ DEL GEN:

Resultats de la cerca de la funció de les diferents proteïnes a la base de dades GeneOntology:
Per AML1:



Per MTG8:


Pel que fa a la proteïna de fusió sabem que intereferix en l’expressió de gens hematopoiètics i és un element important per la generació de la leucèmia. Les translocacions cromosòmiques estan molt involucrades en el desenvolupament de leucèmies ja sigui forçant la l’activació d’oncogens o formant nous gens de fusió. La translocació t(8;21)(q22;q22) és una de les translocacions més freqüent en la leucemia mieloide aguda (AML). Aquesta proteïna de fusió consisteix en la porció N-terminal de ALM1 fusionada mantenint la pauta de lectura amb gairebé tota la proteïna MTG8.

































La proteína AML1 forma complexes heterodimerics amb CBFβ i regula la transcripció dels gens diana unint-se al DNA a través d’un domini d’unió que es troba a la regió N-terminal. Aquest domini d’unió presenta molta homologia amb el gen Runt que és un gen pair-rule de Drosophila. Perquè es produeixi l’activació transcripcional mediada per AML1 també necessita el seu domini de transactivació C-terminal que interactua amb altres coactivadors. L’AML1 és un regulador essencial de molts gens específics de cèl.lules hematopoiètiques.
La proteïna MTG8 conté dos dominis Zn-finger i vàries regions riques en prolina. També interactua amb receptors nuclears correpressors com complexes histona deacetilasa (HDAC) cosa que suggereix la seva funció és de correpressor transcripcional.


La proteïna de fusió AML1-MTG8 conté el domini d’unió al DNA de la proteïna AML1 i la porció de MTG8 que interacciona amb el complexe correpressor HDAC. Per tant és molt probable que la proteína AML1-MTG8 recluti histona deacetilasas als promotors dels gens diana de AML1 i produeixi la deacetilació de les histones d’aquesta regió que resultarà en una repressió transcripcional. Coneixent la funció de AML1 podem concloure que quan això tingui lloc la hematopoiesis definitiva serà absent. A més a més aquesta proteïna no només té aques efecte dominant negatiu sobre AML1 sinó que també se sap que altera l’expressió de diferents gens. Alguns d’aquests gens han estat identificats com és el cas de Tis11b i s’ha vist que participaven en el procés de generació de leucèmia










MÈTODES

La metodología usada per realitzar aquest treball es basa en mètodes computacionals. Primerament, vam haver d’identificar la seqüència proteica assignada al nostre grup. Per fer-ho vam realitzar un alineament amb l’opció tBLASTn i ens vam quedar amb el resultat que presentava una puntuació més alta, un percentatge d’identitat més alt i un evalue més baix. Aquest resultat va correpondre amb el trànscrit de la proteïna de fusió AML1-MTG8.

Posteriorment, per tal de caractertizar l’estructura genòmica vam realitzar un BLAT a la base de dades UCSC i vam obtenir informació sobre les dues proteïnes que formen part de la proteïna de fusió independentment. Paral.lelament, vam realitzar la mateixa cerca de l’Ensembl. En aquestes dues bases de dades la informació que vam buscar per cada trànscrit va ser: número d’exons, posició final, posició inicial, frame, i si es tractaven d’exons codificants, no codificants o híbrids. Finalment ens vam quedar amb els resultats proporcionats per la base de dades RefSeq ja que eren molt més verossímils tenint en compte la seqüència proteica inicial i sabent que es tracta d’una base de dades en que la informació que s’hi trobava es basa en anàlisis funcionals en comptes de en prediccions. A partir d’aquests resultats vam intentar averiguar si eren formes de splicing alternatiu i si aquestes afectaven a la regió codificant. A continuació vam buscar les possibles isoformes de cada proteïna a una tercera base de dades, UNIPROT.

Per tal de buscar informació sobre la homologia de les proteïnas que constitueixen la proteïna de fusió vam usar l’Ensembl. Vam extreure dades sobre el gen, el tipus d’homologia i el percentatge d’identitat. A més a més vam realitzar un altre aliniament amb la seqüència de nucleòtids en FASTA de la proteïna de fusió per averiguar si aquesta presentava algun ortòleg en altres espècies. Però en el resultat no vam obtenir cap homòleg per la proteína sencera, només per les diferents parts de la proteïna tal i com haviem obtingut prèviamet amb l’ensembl, per tant no ho vam incloure en els resultats.

Per duu a terme la caracterització de l’expressió; del gen ens vam basar una opció que ens proporcionava la base de dades UCSC . Vam usar la opció Gene Atlas-2 que com hem explicat abans es basa en assajos d’expressió realitzats a partir de microarrays amb mostres de diferents teixits.

Per caracteritzar la regió promotora, primerament, vam haver d’obtenir la regió promotora (es va considerar regió promotora 1000pb abans del TSS i 100 pb després) en format fasta. Per fer-ho vam usar la opció de Table browser de la base de dades UCSC. Una vegada obtingudes les regions promotores per els tres trànscrits que poden formar part de la proteïna de fusió, vam analitzar-la per tal de trobar-hi possibles llocs d’unió de factors de transcripció. Aquest anàlisi el vam elaborar de dues formes diferents: primer a través del programa PROMO i seguidament a través d’un programa perl elaborat per nosaltres que es basa en una simplificació del PROMO. Els dos programes segueixen el mateix principi: a partir d’una matriu d’ocurrències per cada factor de transcripció, elaboren una matriu de pesos, i apartir de la matriu de pesos, es puntuen els possibles llocs d’unió del factor que vagin trobant a la seqüència on es vulgui realitzar la cerca. Com he dit anteriorment, el nostre programa es tracta d’una gran simplificació i per tant serà molt menys sensible.
Dels resultats que vam obtenir amb el PROMO, a partir d’una cerca amb els següents filtres: que només busqués factors de transcripció humans, només llocs d’unió humans i que presentessin un índex de dissimilaritat inferior o igual al 15%, ens vam quedar només amb aquells que presentessin un RE equally inferior a 0,09, ja que vam considerar que es tracta d’un número suficientment baix com per poder discriminar aquells casos no significatius.
Dels resultats que vam obtenir amb el nostre programa vam escollir aquells que presentaven un pvalue inferior a 0,2 també considerant que es tractava d’un valor força raonable per discriminar els casos no significatius. Vam utilitzar un p-value relativament més alt perquè com he dit anteriorment, el nostre programa no és tant sensible i si restringim molt el p-value encara limitariem més els resultats obtinguts.
Finalment vam comparar els resultats obtinguts amb els dos mètodes per tal d’averiguar si algun dels factors de transcripció coincidia en els dos resultats. Això va ser així en alguns casos, però sorprenentment quan es van analitzar al detall ens vam adonar que ni la longitud ni la composició de nucleòtids coincidia.

A l’hora de buscar informació sobre la funció del gen vam utilitzar dues bases de dades: la base de dades Gene Ontology on vam cercar informació de les dues proteïnes per separat i el Pubmed on vam buscar articles sobre la proteïna de fusió.



DISCUSSIÓ

En aquest treball el que es preten és estudiar els diferents aspectes d’un gen a través del seu analisi computacional. L’estudi es va iniciar amb una seqüència proteica de la qual es desconeixia la identitat. Per identificar-la vam realitar un alineament amb Blast contra tot el genoma humà. El resultat va ser una proteïna de fusió anomenada AML1-MTG8. Aquesta proteïna es produeix per una translocació que ajunta un gen del cromosoma 21 (AML1) amb un gen al cromosoma 8 (MTG8). En aquest procés no es trenca la pauta de lectura de manera que dóna un trànscrit de fusió AML1-MTG8. Aquesta translocació t(8;21) porta al desenvolupament de leucemia mieloide aguda i és una de les translocacions més freqüents en aquest tipus de càncer.

Per caracteritzar l’estructura genòmica del gen vam estudiar les dues proteïnes per separat. Pel que fa a AML1 segons les dades de refSeq, observem que presenta dos trànscrits amb número i longitud d’exons diferents. Amb aquestes dades juntament amb la informació sobre la fase en que s’acaben els diferents exons podem concloure que es tracta de diferents isoformes generades per splicing alternatiu i buscant les isoformes vam poder concloure que aquest afectava a la regió codificant. De tots els resultats obtinguts l’únic que podia formar part de la proteïna de fusó tenint en compte la seqüència d’aquesta era el trànscrit número 1 de RefSeq (NM_001001890) que corresponia a la isoforma 1 de Uniprot (Q01196). Pel que fa a MTG8, amb les dades de RefSeq obtenim 4 trànscrits diferents, Els 1er d’aquests 4 presenta diferents número i longitud d’exons. Els altres 3 tenen els mateix número d’exons i només difereixen en la longitud i porció codificant del primer exó. Aquests 4 trànscrits són els resultat d’un procés de splicing alternatiu. Per altra banda, vam cercar informació sobre les isoformes i a la base de dades Uniprot en vam trobar 2 que correponen a :MTG8a i MTG8b. Comparant les seqüències concluïm que es correponen amb els trànscrits NM_004349 i NM_175634.

A l’hora d’evaluar l’homologia del gen que codifica per la proteïna de fusió amb altres espècies vam realitzar un BLAST, però en el resultat no vam trobar seqüència en altres espècies que sigui homòloga a la proteïna de fusió sencera sino que eren homòlogues o bé a la porció que codifica per AML1 o per MTG8. Per tant una vegada més vam analitzar els resultats per separat. Pel que fa a AML1, tant sols observem resultats d’homologia alts en espècies filogenèticament molt properes. En canvi, per MTG8 observem percentatges d’identitat més alts fins i tots en espècies més allunyades filogenèticament cosa que suggeriex que es podria tractar d’una proteïna més conservada.

Per caracteritzar l’expressió d’aquesta proteïna vam buscar resultats d’analisis d’expressió. En aquests vam trobar informació de les dues proteïnes per separat. AML1 s’expressa en teixit cancerós i sistema immunitari mentre que MTG8 s’expressa en múscul i cervell. Paral.lelament vam buscar informació en articles sobre l’expressó de la proteïna de fusió. La informció obtinguda coincida gairebé al 100% amb l’expressió de les proteïnes per separat amb l’excepció de que MTG8 no era present ni en teixit cancerós ni en teixit hematopoiètic quan s’analitza per separat però si quan forma part de la proteïna de fusió. Aquest és el primer indici que insinuava ja que AML1 és un factor molt important per les cèl.lules hematopoiètiques i que probablement la seva activitat es veurà interferida al fusionar-se amb MTG8.

Per tal de caracteritzar la regió promotora del gen vam buscar les seqüències promotores pels 3 trànscrits que poden formar part de la proteïna de fusió. Amb aquestes seqüències es van realitzar prediccions dels diferents llocs d’unió de factors de transcripció que podiem trobar al llarg de cada seqüència promotora. Aquestes prediccions es van realitzar seguint dues metodologies diferents el programa PROMO i el programa en perl elaborat per nosaltres. Amb el programa PROMO utilitzant els límits ja comentats en l’apartat de resultats i metodologia vam obtenir: 65 prediccions per AML1, 60 per MTG8A i 65 per MTG8B. Per altre banda els resultats obtinguts amb el nostre programa van ser: 2 per AML1, 3 per MTG8A i 5 per MTG8B. Els resultats obtinguts pels dos mètodes coincideixen per alguns factors de transcripció: per AML1 comparteixen NF-AT1, per MTG8A comparteixen: NA-SFR i RXR-alpha i per MTG8B comparteixen AP-1, AR, NF_AT1 i PU.1. No obstant, quan mirem les seqüències que corresponen als llocs d’unió per aquests factors de transcripció trobades per cadascun dels mètodes s’observa sorprenentment que difereixen tant en longitud del motiu com en composició de nucleòtids. Aquest fet es deu a que inicialment creiem que els dos programes partien de les mateixes matrius d’ocurrències però al buscar les matrius del programa promo ens vam adonar que no eren les mateixes que teniem al fitxer per elaborar el programa. El fet que per un mateix factor de transcripció puguem tenir matrius d’ocurrències diferents en composició de nucleòtids es podria deure a que el lloc d’unió d’aquests factors transcripció sigui molt heterogeni.

A l’hora d’estudiar la funció del gen ho hem fet a partir de dos perspectives diferents: d’una banda vam analitzar la funció de cada proteïna per separat a la base de dades GeneOntology i per l’altre vam buscar informació sobre la proteïna de fusió en diferents articles. Dels resultants obtinguts concloem que les dues proteines actuen com a factors de transcripció i presenten diferents dominis d’unió al DNA. Pel que fa a AML1 sabem que es tracta d’un regulador essencial de molts gens hematopoiètics mentre que MTG8 també interacciona amb receptors nuclears però en aquest cas són correpressors com complexes histona deacetilasa i per tant actua coma correpressor transcripcional. Pel que fa a la proteïna de fusió se sap que interfereix en l’expressió de gens hematopoiètics i que té un paper essencial en la generació de leucèmia mieloide aguda . Aquesta proteïna manté el domini d’unió al DNA de AML1 i el domini de MTG8 que interacciona amb el complexe histona deacetilasa. És fàcil de pensar doncs, que el que aquesta translocació provocarà serà l’acúmul de histona deacetilases als promotors dels gen que es troben sota el control de AML1 i per tant serà una mutació amb efecte dominant negatiu de AML1 i farà que la diferenciació hematopoiètica final sigui completament abscent. A més s’ha comprovat a través d’assajos d’expressió que aquesta proteïna de fusió altera també l’expressió de diferents gens alguns dels quals se’n coneix la seva participació en el procés de generació de leucèmia.



REFERÈNCIES