En este apartado discutiremos de manera global los resultados obtenidos en la sección anterior.
Con la información obtenida gracias a los BLASTN y TBLASTX realizados, podemos descartar
los plásmidos pRiA4, pTiC58, pTi15955 y el de Streptomyces halstedii como homólogos del
plásmido pRi2659 por las siguientes razones:
- Plásmido pRiA4: a pesar de que al plásmido pRiA4 en la literatura se le asigna
[G.Hansen, M.Larribe et al. 1991] un ORF13 homólogo (con una homología a nivel nucleotídico de 86.7% y aminoacídico
del 76.8% con respecto a pRi8196), en nuestro caso no hemos encontrado tal homología. Esto puede ser debido a que este
plásmido es el denominado en NCBI como "pRiA4 plasmid TL-DNA rolB-C genes", es decir,
un fragmento del plásmido entero (no disponible en las bases de datos).
- Plásmidos pTiC58 y pTi15955: no presentan homologías significativas con la región
que corresponde al gen ORF13. Este hecho es muy importante ya que son los únicos que pertenecen a una
especie diferente de A.Rhizogenes. Destacar a su vez, que los dos pertenecen a A.tumefaciens, una especie patógena
en la que otros genes, como ORF8, mantienen una elevada homología.
Con todo esto, podemos intuir que ORF13 tiene un papel específico y determinante en A.rhizogenes.
- Plásmido de Streptomyces halstedii: el grado de homología que presenta es muy bajo, de hecho,
todo se reduce a coincidencias puntuales.
Estas conclusiones se intuyen fácilmente con los diversos BLASTs realizados vía web que,
a su vez, se ven reforzadas con los BLASTs elaborados en command line.
Por tanto, a partir de ahora únicamente trabajaremos con los plásmidos pRi2659, pRi1724 y pRi8196,
y es con los que realizamos el clustalW.
A partir de los output obtenidos de los clustalW a nivel tanto protéico como aminoacídico,
vemos que existe gran homología entre los plásmidos pRi2659 y pRi1724, aunque tampoco
son despreciables los valores obtenidos para el pRi8196 (Tabla 1).
PUNTUACIONES de las PROTEÍNAS en CLUSTALW
|
Plásmidos comparados
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Score nucleotídico
|
Score aminoacídico
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pRi2659-x-pRi1724
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97
|
94
|
|
pRi2659-x-pRi8196
|
85
|
73
|
|
pRi1724-x-pRi8196
|
84
|
71
|
Tabla 1: puntuaciones en CLUSTALW
Esta homología se ve reflejada en el esquema del alineamiento que podemos encontrar en el
apartado 5 de resultados.
Por otro lado, en el estudio con z-picture visualizamos de forma más detallada
la conservación de las regiones singénicas e intergénicas (mostrado en
el apartado 6 de resultados).
En cuanto a la región singénica podemos comentar que:
- la conservación entre los plásmidos pRi2659 y pRi1724 es
casi del 100% a lo largo de toda la secuencia (incluido ORF13), con la excepción
de una pequeña disminución en la región que abarca el final del gen ORF11
y parte de la región no codificante entre los genes ORF11 y ORF12.
- la conservación entre los plásmidos pRi2659 y pRi8196 es menor
e irregular, con una mayor conservación en los genes ORF13, ORF13a y ORF14.
En cuanto a la región intergénica podemos comentar que:
- la conservación entre los plásmidos pRi2659 y pRi1724 es
prácticamente del 100%, con una pequeña disminución downstream
de ORF13.
- aunque la conservación entre los plásmidos pRi2659 y pRi8196 es menor,
la secuencia codificante presenta una mayor homología que el conjunto de la
región intergénica. Cabe destacar que la semejanza a nivel del promotor
es mayor, incluso, del 100%.
Una vez constatada la gran homología existente,
procedemos a anotar los dominios putativos de ORF13 con interpro. Como era de
esperar, se obtuvo el mismo dominio proteico en los tres casos (apartado 7 de los resultados),
que corresponde a la "Cytokinin glycosidase".
Debido a las puntuaciones obtenidas (Tabla 2), podemos decir que el resultado es fiable.
PUNTUACIONES en INTERPRO
|
Plásmidos
|
Puntuación
|
|
pRi2659
|
7,6 e-66
|
|
pRi1724
|
2,4 e-65
|
|
pRi8196
|
2 e-67
|
Tabla 2: puntuaciones en INTERPRO
En interpro se identifican los genes rolB y rolC como los codificantes para la
"Cytokinin glycosidase", que a su vez, aparecen como homólogos de
ORF11 y ORF12 respectivamente en la literatura.
Estos dos oncogenes, que recordemos se encuentran en el T-DNA de Agrobacterium rhizogenes,
perturban el crecimiento y desarrollo de la planta por condificar para beta-glucosidasas
con diferentes especificidades. Mientras que las beta-glucosidasas de rolC dan lugar a citokininas
libres a partir de sus conjugados glucosídicos, la proteína codificada por rolB
hidroliza indol-beta-glucósidos.
De esta manera, se espera que la acción combinada de estos dos genes module la concentración
intracelular de los dos factores de crecimiento principales activos en plantas y sea el causante de los
cambios observados a nivel fisiológico y en el desarrollo[J.J.Estruch, J.Schell et al. 1991 y
J.J.Estruch, D.Chriqui et al. 1991].
Teniendo en cuenta la información presentada en los artículos comentados y que el dominio
putativo otorgado a ORF13 es "Cytokinin glycosidase", nuestra hipótesis es que ORF13 ejerce una
función similar a ORF11 y ORF12.
Para confirmar la hipótesis y poder determinar la regulación de ORF13, es importante conocer
el promotor que lo regula. Con CLUSTALW confirmamos que, en mayor o menor medida, los promotores se conservan
(tabla 3).
PUNTUACIONES de los PROMOTORES en CLUSTALW
|
Plásmidos
|
Puntuación
|
|
pRi2659-x-pRi1724
|
98
|
|
pRi2659-x-pRi8196
|
66
|
|
pRi1724-x-pRi8196
|
66
|
Tabla 3: puntuaciones en CLUSTALW
Los posteriores estudios realizados al respecto con TRANSFAC no han sido satisfactorios, ya que
únicamente se identifican promotores que corresponden a organismos eucariotas con una función
totalmente independiente a las citokinas. Por ello, creemos que la base de datos de TRANSFAC
es limitada para promotores bacterianos, de manera que no hemos podido obtener ningún promotor
que sea coherente con nuestra hipótesis.
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