El factor de transcripción CREB (factor en respuesta a AMPc) se ha visto implicado en una amplia gama de procesos biológicos, como el metabolismo de la glucosa, supervivencia celular, y funciones neurales complejas como el aprendizaje y la memoria. Los miembros de la família de CREB se unen al DNA vía una región conservada con un dominio de "cremallera de leucinas" que reconoce el elemento de respuesta a AMPc CRE.
Numerosos estudios de regiones promotoras sobre las cuales actuaba el factor CREB han llevado a la identificación de la secuencia palindrómica consenso "TGACGTGA"de unión al DNA.Ésta no es la única secuencia sobre la cual se ha visto unión de CREs, ya que también se une con una menor frecuencia a un motivo que reproduce la mitad de la secuencia consenso anterior "TGACG".
Recientemente varios grupos han aplicado técnicas informáticas y realizado comparaciones entre el genoma de ratón y el humano para identificar genes diana del sistema circadiano, y de los activadores transcripcionales de myc. Estos estudios se realizaron buscando secuencias consenso, matrices de pesos, o algoritmos diseñados para la detección de genes diana. Los autores de este artículo aplicaron estas técnicas para elaborar un mapa de la distribución del factor de transcrpción CREB utilizando el modelo de Markov oculto (HMM) sobre el genoma humano y de ratón.
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Se sabe que CREB como muchos otros factores de transcripción se une en zonas próximas al TSS, por lo que focalizaron la búsqueda a 10 kb por encima de la metionina de inicio de transcripción. A esta distancia estimaron que deberían encontrar el 88% de los sitios de unión, que están como media a 150bp del TSS. El análisis resultó en la identificación de 1349 sitios de unión en ratones y 1663 en humanos, sugiriendo la existencia de genes diana de CREB en el genoma de los mamíferos, muchos de ellos conservados en diferentes especies. La mayor parte de los CREs conservados se encontraban a menos de 1000 bases del codón de inicio ATG, a unas 250 bases del 5' UTR. "Ver figura".
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Se sabe que CREB como muchos otros factores de transcripción se une en zonas próximas al TSS, por lo que focalizaron la búsqueda a 10 kb por encima de la metionina de inicio de transcripción. A esta distancia estimaron que deberían encontrar el 88% de los sitios de union, que están como media a 150bp del TSS.
El análisis resulto en la identificación de 1349 sitios de unión en ratones y 1663 en humanos, sugiriendo la existencia de genes diana de CREB en el genoma de los mamíferos, muchos de ellos conservados en diferentes especies. La mayor parte de los CREs conservados se encontraban a menos de 1000 bases del codón de inicio ATG, a unas 250 bases del 5' UTR.
El estudio de los genes diana de CREB reveló que un 60% de las dianas de mayor puntuación correspondían a activadores o coactivadores de transcripción o implicados en señalización citoplasmática.
También se observó expresión diferencial de genes que contenían CRE en neuronas, como por ejemplo codificantes de proteínas involucradas en especificación neuronal (LHX1, EVX1) o formacion de sinapsis(SYN1).
Las dianas con puntuaciones mayores contenían el motivo consenso "TGACGTGA" mientras que los genes con puntuaciones menores contenían sólo una parte del motivo("TGACG").
Comprovaron la unión de CREB a estas dianas en vivo con inmunoprecipitación (usaron anticuerpos específicos anti-CREB)de cromatina en celulas 293T y amplificación con PCR. Estos ensayos verificaron la unión de CREB a las dianas predichas por el ordenador.
Para comprovar la inducción de CREB provocaron el aumento de AMPc intracelular estimulando las células con forscolina. Los resultados mostraron aumento de la transcripción de aquellos genes en los que CREB estaba situado próximo a la caja TATA mientras que no había efecto sobre los genes sin caja TATA en su región promotora. Concluyeron que la activación célular de promotores mediante AMPc requeria de la presencia de una caja TATA cercana.
A fin de determinar el papel de CREB en la regulación de sus dianas potenciales, se creó un dominante negativo que tenía el dominio de cremallera de leucinas unido a un péptido acídico (A-CREB) con lo cual quedaba bloqueada su unión a DNA.La expresión de A-CREB en celulas de la linea 293T mostraba un bloqueo de la expresión inducida por AMPc en aquellos genes que contenían la caja TATA en su región promotora, pero no había una alteración aparente en los niveles de expresión basal de dichos genes. Asimismo tampoco observaron efectos en los niveles basales de expresión de aquellos genes que no tenían la caja TATA.Estos resultados demostraron, que CREB, como la mayoría de fractores de transcripción no actúan en solitario controlando la expresión de un gen, sino que la regulación es llevada a cabo por diferentes factores.
Resumiendo, este artículo se asemeja bastante a la manera en como hemos analizado nuestros datos, ya que trata de establecer la presencia de regiones hipotéticamente capaces de unir CREB a partir de la búsqueda sobre el genoma de de secuencias consenso. Los resultados obtenidos cubren mas información de la que nosotros podemos abarcar con nuestro estudio, ya que también han podido hacer ensayos de inducción y comprobar de esta manera una presumible relación entre la presencia de la caja TATA en las regiones promotoras de genes con secuencias candidatas a unir CREB, y un incremento de la transcripción cuando en estas células se produce un aumento intracelular de AMPc.