Señales de splicing

Iniciales: Delimitados por un codón inicial (ATG) y un donnor site.

Internos: Delimitados por un acceptor site y un donnor.

Terminales: Delimitados por un donnor site y un codón STOP (TGA, TAG y TAA).

Singles: Delimitados por un codón inicial y un STOP.

Sesgo codificante

El uso de codones en los exones que se traducen a proteína no es aleatorio, sino que existe un sesgo en el uso de codones concretos en función del organismo. Este hecho puede ser utilizado para puntuar los exones según los codones que utiliza y ver si un exón tiene más posibilidades de ser un exón real en este organismo. Si un exón utiliza más codones de nuestra tabla le daremos una puntuación mayor.

Matriz de donnors:

               P0       A        C       G        T
	       01   0.302    0.483  -0.305   -0.856
	       02   0.817   -0.667  -0.743   -0.474
	       03  -1.143   -0.782   1.123   -1.660
	       04   -9999    -9999   0.000    -9999
	       05   -9999    -9999   -9999    0.000
	       06   1.083   -2.097   0.135   -2.246
	       07   1.032   -1.093  -0.627   -1.111
	       08  -1.218   -1.479   1.257   -1.534
	       09  -0.411   -0.358  -0.136    0.492
	       XX 3

Matriz de acceptors:

           P0       A       C        G       T
                01  -0.459   0.241   -0.409   0.357   
                02  -0.495   0.252   -0.540   0.418   
		03  -0.511   0.192   -0.495   0.456
		04  -0.614   0.280   -0.639   0.474   
		05  -0.775   0.305   -0.642   0.504   
		06  -0.955   0.304   -0.666   0.557   
		07  -1.061   0.258   -0.768   0.639   
		08  -1.176   0.300   -0.788   0.634   
		09  -1.302   0.238   -0.923   0.723   
		10  -1.227   0.388   -0.881   0.597   
		11  -1.049   0.341   -0.773   0.577   
		12  -1.007   0.460   -0.758   0.458   
		13  -1.163   0.525   -1.188   0.526   
		14  -1.311   0.582   -1.401   0.527   
		15  -1.093   0.414   -1.503   0.657  
		16   0.030   0.151   -0.117  -0.086  
		17  -1.860   1.093   -4.269  -0.165   
		18    0.00   -9999    -9999   -9999   
		19   -9999   -9999     0.00   -9999      
		20  -0.064  -0.513    0.732  -0.957   
		21  -0.075  -0.220   -0.087   0.302 
		XX 20

Se podrían utilizar matrices diferentes de las anteriores (por ejemplo de otra especie) pero con el mismo formato.

	    
	             GGG 0.01708
		     GGA 0.01931
		     GGT 0.01366
		     GGC 0.02494
		     GAG 0.03882
		     GAA 0.02751
		     GAT 0.02145
		     GAC 0.02706
		     GTG 0.02860
		     GTA 0.00609
		     GTT 0.01030
		     GTC 0.01501
		     GCG 0.00727
		     GCA 0.01550
                     ...

Si quiere bajar el fichero con las proporciones de codones en humanos para utilizarlo en nuestro servidor pulse aquí

	     predictor    internal     101     134     0.123       +       0
        

1. nombre del programa
2. descripció del tipo de exón: inicial, interno, terminal o single
3. posición de inicio del exón
4. posición de final del exón
5. puntuación del exón
6. strand (en nuestro caso siempre será positivo)
7. frame (0, 1 o 2): es importante para poder ensamblar los exones predichos utilizando algún otro programa

1. Fichero con la secuencia en formato fasta.
2. Matriz de pesos de los donnors sites.
3. Matriz de pesos de los acceptors sites.
4. Fichero de proporcióde los codones
5. Umbral de donnors y acceptors (puntuación mínima que queremos considerar como posible lugar de splicing)
6. Tamaño mínimo del exón.

• En primer lugar con fichero de proporción de codones se crea un hash, en el que relacionamos un codón concreto (palabra clave) con la probabilidad de que aparezca en una región codificante determinada (valor). Esto nos servirá posteriormente para calcular la razón de verosimilitud de los exones que predigamos.
  
  
• En segundo lugar guardamos en una variable la secuencia que introducimos en formato fasta, pero sin el signo > ni la palabra identificadora que aparecen en dicho formato (nos quedamos únicamente con la secuencia de nucleótidos).
  
  
• Por último es importante apreciar que se obtienen tres secuencias a partir de la original:
  
  
  1. La secuencia que acabamos de almacenar
  2. La secuencia eliminando un nucleótido
  3. La secuencia eliminando dos nucleótidos

  Así conseguimos tener en cuenta las tres posibles pautas de lectura de la maquinaria celular sobre la secuencia de DNA.

  Los pasos del programa descritos a continuación que empiezan por (3x) se realizan por triplicado para estas tres secuencias que hemos creado.

• (3x) Búsqueda de los codones STOP (TAA,TAG,TGA) para definir los marcos de lectura (Open Reading Frames u ORFs). Este primer paso es muy importante porque un exón no puede estar partido por un codon stop, es necesrio definir los ORFs para buscar los exones dentro de estos marcos de lectura y no en toda la secuencia. Lo hacemos mediante la función "calcula_stops" que al introducirle una secuencia de DNA te devuelve una matriz donde la primera columna es un trozo de secuencia ente codones STOP, un orf, y la segunda es la posición del último nucleotido de cada ORF.Por ejemplo:

  			ATTGCCACTGGTAA		14
  			...
  		

  
  
• Utilizamos la función "llegeix_matriu_pesos" para leer las matrices de pesos de donnors y acceptors que hemos introducido como parametros y almacenar cada una en un hash para su utilización en las dos funciones siguientes.
  
  
• Gracias a la función "calcula_donor_aceptor" calculamos las posiciones de las señales de splicing dentro de los orfs que habíamos definido y las puntuamos con los hashes de la función anterior.

  Obtenemos dos matrices, la de puntuación de donnors y la de puntuación de acceptors (dependiendo de si damos como parámetros el hash resultante de leer la matriz de donnors o la de acceptors). Esta función utiliza también como parámetros la matriz inicial con los orfs y posiciones y un umbral o puntuación mínima que introducimos como argumento. Lo que obtenemos es una matriz con tres columnas, de este tipo:

  		orf		posicion donnor		puntuacion donnor
  		...
  	

  
  
  
• (3x)El siguiente paso es calcular el frame de los posibles exons que construiremos a partir de las señales de splicing que ya hemos calculado. Para calcular el frame lo primero que hay que tener en cuenta es que los codones de los exones que predigamos tiene que estar en la misma pauta que el codón stop que delimita el orf. La función "calcula_frame" tiene en cuenta que:
  
  
  1. Si el número de bases entre el inicio del orf y el final del intrón (base anterior a la señal acceptora de splicing) es divisible entre 3 quiere decir que será FRAME 0.
  2. Si al dividir entre tres el residuo es dos: FRAME 1
  3. Si al dividir entre tres el residuo es uno: FRAME 2
  
  Hay que tener en cuenta que el frame de los exones iniciales y de los single siempre es 0.
  Esta funcion añade una columna a la matriz de puntuación de acceptors, en esa columna se especifica el frame (la matriz de puntuación de donnors no se modifica, porque calculamos el frame a partir de los acceptors).

  	orf		posicion acceptor		puntuacion acceptor		frame
          ...
  	

  
  
  
• (x3)Empezamos calculando los exones internos: calculamos todas las posibles combinaciones entre acceptor-donnor que cumplan que la posición del acceptor sea anterior a la del donnor y que esten en el mismo orf. Esto lo conseguimos con la función "combi", que nos devuelve una matriz con seis columnas:
  
  
  1. suma de puntuacoines acceptor-donnor
  2. posicion relativa del acceptor
  3. posicion relativa del donnor
  4. posicion absoluta del acceptor
  5. posicion absoluta del donnor
  6. secuencia entre acceptor y donnor (exón putativo).
  
  Con posición relativa nos referimos a la posición dentro de un orf, y con la absoluta a la posición en la secuencia entera.
  
  
• (x3)Para calcular el sesgo codificante de los exones putativos por el uso de codones usamos la función "biaix_codificant", que añade una columna a la matriz anterior en la que suma la posición de las señales de splicing a la de el uso de codones.
  
  
• (x3)Para calcular exones iniciales tenemos que emparejar codones ATG con donnors. Los ATGs los buscamos gracias a la función "busca_ATG", y el emparejamiento con los donnors se hace mediante la función "combi". También tenemos que calcular el sesgo codificante de las secuencias (función "biaix codificant")
  
  
• (x3)Los exones terminales y single se calculan igual pero se hacen parejas acceptor-STOP y ATG-STOP respectivamente. Tambien se pasan por las funciones "combi" y "biaix_codificant".
  
  
• Ya tenemos los posibles exones iniciales, internos, terminales y singles, pero tenemos tres matrices para cada tipo de exón. Para unir las tres marices de un tipo de ex&on utilizamos la función "unir_tres_matrius". Ahora añadimos a cada una de las cuatro matrices que nos quedan una columna que diga el tipo de exón que es, por ejemplo "terminal", para poder distinguir unos de otros cuando unamos todas las matrices.
  
  
• Ahora tenemos una matriz para cada tipo de exón (iniciales, internos, terminales y singles), y las juntamos todas en una mediante la función "unir_quatre_matrius". Asi conseguimos una matriz final que tiene nueve columnas:
  
  
  1. suma de puntuacoines acceptor-donnor
  2. posicion relativa del acceptor
  3. posicion relativa del donnor
  4. posicion absoluta del acceptor/ATG
  5. posicion absoluta del donnor/STOP
  6. secuencia del exón putativo
  7. suma de puntuaciones: señales de splicing + uso de codones
  8. frame
  9. tipo de exón
  
  
  
• Imprimiendo las columnas que nos interesen de la matriz final conseguiremos el formato GFF.