INTRODUCCIÓN:

     Un ejemplo de este tipo de estudios lo encontramos en el articulo “Gene expression profiling predicts clinical outcome of breastcancer” publicado en Nature (Nature, vol.415, 530-535) en Enero del 2002. En éste,  se intentó encontrar mediante la técnica de microarray de DNA un set de genes que permitiera predecir el desarrollo de cáncer de mama (uno de los que tiene mayor incidencia mundial) , causando cerca de trescientasmil muertes cada año.

    Basándose en este artículo se ha intentado comprobar si un nuevo set de genes con distintas condiciones de expresión sería igualmente predictivo. Para esto se creó un programa en lenguaje Perl (geneselection.pl) que permitía seleccionar de un grupo de genes sólo aquellos que cumplían unas determinadas condiciones de expresión. Los resultados fueron procesados utilizando dos programas, Cluster(para el cálculo de distancias de expresión) y TreeView(para su visualización).
 

ARTÍCULO:

     Se ha visto que sólo entre un 20% y un 30 % de los tratamientos con quimioterapia en mujeres con cáncer primario de mama eran realmente necesarios, ya que el resto de casos hubieran podido sobrevivir sin él. He aquí la necesidad de tener un set de buenos predictores genéticos .

     Para encontrar el set de genes se analizó el DNA de 117 mujeres con cáncer primario de mama, de las cuales se seleccionaron 98: 78 esporádicos ( 34 desarrollaron metástasis en menos de 5 años y 44 tardaron más), y el resto no esporádico o hereditario ( mutación en el gen de BRCA1 o BRCA2).  De cada tumor se analizaron por DNA microarray  25,000 genes  obtenidos de dos base de datos:( Ref Seq  y  ESTs)  También se incluyeron unos 1,200 genes que no tenían relación con el cáncer para utilizarlos como control. De estos genes se obtuvieron los oligos que se utilizarían para hacer dos hibridaciones  con las muestras problema.

    Se extrajo 5 microgramos de RNA de cada uno de los tumores obteniéndose su cRNA mediante transcripción in vitro y se marcó con fluorescencia  (CyDye). A partir de estas muestras se creó un pool que contenía cantidades iguales de los tumores esporádicos para obtener un valor de expresión de referencia.

     Tras la hibridación se quantificó la fluorescencia por microscopia láser confocal obteniéndose un valor de expresión que se utilizó para calcular el ratio de expresión (expresión gen/expresión referencia).

     Del conjunto total, 5,000 genes cumplían las siguientes condiciones de expresión:

· Pvalue menor o igual al 0.01.
· Una expresión dos veces mayor o dos veces menor que el valor de referencia (ratio de expresión)
· Que las dos condiciones anteriores se cumplan como mínimo en 5 tumores.

    Para ver la relación de expresión entre estos 5,000 genes se realizó un algoritmo de agrupamiento (o clustering) jerárquico no supervisado, que también se aplicó para encontrar similitudes entre los 98 tumores. A partir de este clustering se delimitaron dos grupos diferenciados (imagen 1a).
 
 

   (*)Imagen 1a:  el grupo superior (prognosis favorable) corresponde a 62 tumores, la mayoría de los cuales (66%) no desarrollaron metástasis en menos de 5 años; mientras que el grupo inferior (prognosis desfavorable) corresponde a 36 tumores, la mayoría de los cuales (70%) desarrollaron  metástasis.
 
 

     Además se buscaron parámetros clínicos asociados al cáncer (expresión receptor de estógenos ER, mutaciones en la línea germinal de BRCA1,  infiltración linfocítica, angioinvasión, y grado del tumor) (imagen 1b).

    (*)Imagen 1b:  se observó que en el grupo de prognosis favorable había menor infiltración linfocítica, mayor expresión del gen de ER-alfa y no presentaba mutación en el gen BRCA1, mientras que en el grupo de prognosis desfavorable el patrón es opuesto (el negro significa expresión negativa y el blanco expresión positiva)
 
 

    En los resultados de este primer análisis se observa un cierto error en el pronóstico de las pacientes. Con tal de mejorarlo,  se seleccionan otros 5,000 genes de entre los 25,000 iniciales, siguiendo un método parecido al anterior, pero esta vez el gen únicamente debía expresarse en tres o más tumores esporádicos. Seguidamente se calcularon los coeficientes de correlación de cada uno de estos genes, destacando 231 por tener una correlación altamente significativa con el desarrollo de la enfermedad (más de 0.3 o menos de -0.3). Se ordenaron en virtud a una mayor o menor correlación y se fueron añadiendo en grupos de 5 genes, esta vez utilizando un método de clustering supervisado (leave-one-out), al set de 5000 genes predictivos iniciales, con tal de optimizarlo (imagen 2b).
 

(*) Imagen 2b: en el panel izquierdo se observan los 78 tumores divididos según su prognosis. En el panel de la derecha se muestra la tendencia de correlación (línea de puntos azules), así como la aparición de metástasis (barras  blancas).
 

    Así se obtuvo un set definitivo de 70 genes   que establecía un umbral de exactitud  (línea contínua en el panel izquierdo de la imagen 2b) que permitía diferenciar entre el grupo de prognosis favorable (44 tumores) y desfavorable  (34 tumores). A pesar de la eficacia del método de clasificación  13 de los 78 tumores se clasificaron de forma incorrecta (sensibilidad del 83%), por lo que se definió un umbral de sensibilidad  (línea discontínua del panel izquierdo de la imagen 2b) que permitía un error menor al 10%.

    Esta selección de 70 genes fue contrastada con resultados obtenidos por otros grupos, viéndose que ninguno de nuestros genes se incluía en dichos resultados. La explicación la podríamos encontrar en el hecho de que los estudios anteriores se basaban en el nivel proteíco mientras que en éste se analizó la expresión del gen.

GENESELECTION.PL

    Este programa nos selecciona , dado un fichero de genes que se expresan en tumores, aquellos que cumplan una serie de condiciones : nivel de expresión (calculado como  log₁₀ del ratio), p-value y número mínimo de tumores en los que se expresan. De esta manera podemos obtener ficheros con subconjuntos de genes que suponemos más o menos relacionados con el desarrollo de la enfermedad.
 

    Qué hicimos?

•     Se parte de los mismos 5,000 genes (fichero inicial ) que utilizaron en el artículo y se utiliza geneselection.pl, variando las condiciones de expresión para conseguir un  subconjuntos de genes .

•    Utilizamos  tres grupos de genes  que fueron elegidos como altamente predictivos en estudios anteriores (BRCA1, ER y prognosis), para ver que  proporciones de estos genes se corresponden con los del fichero inicial (tabla 1) y saber si son significativos en nuestro estudio.

•    Se repite el paso anterior utilizando los subconjuntos de genes creados en el primer paso (tabla2) obteniendo unos nuevos ficheros (ficheros cw ) donde estarán aquellos genes predictivos que se expresan en determinadas condiciones de p-value, logaritmo del ratio y número de tumores.

•     Ejecutaremos el programa Cluster con algunos de los ficheros cw para conseguir la matriz de distancias:

                   2- Genes que se expresan como mínimo en 30 tumores con un ratio de expresión mayor o igual a 2.
                                * genes predictivos BRCA1: cwbrca30tr2.txt
                                * genes predictivos ER: cwer30tr2.txt
                                * genes predictivos prognosis: cwpr30tr2.txt
 

•   Una vez obtenidas las matrices las utilizaremos para visualizar los árboles correspondientes con el programa TreeView.

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Análisis de los datos

        Análisis de la tablas de datos:

    Para hacer las selecciones  variamos dos condiciones de expresión: el ratio (2 y 3) y el número de tumores (5, 15 y 30). Comprobamos que una variación del ratio tiene mayor repercusión en el número de genes que una  variación en el número de tumores  expresados (tabla 2).

    Al restringir las condiciones de expresión, el número de genes del fichero inicial  disminuye,así como el número de genes BRCA1, ER y prognosis. Si el método de selección fuera bueno el número de genes de BRCA1, ER y prognosis se mantendría mientras que el resto disminuiría,  lo que significa que su porcentaje  debería aumentar en lugar de conservarse (tabla 3). Esto nos permite concluir que unas condiciones de expresión muy estrictas originan una pérdida importante de información, para obtener un diagnóstico correcto de la evolución de la enfermedad se necesita analizar un cantidad mayor de genes.
 

        Análisis de los árboles:

    Primeramente, analizamos los genes BRCA1,ER y prognosis coincidentes con el fichero inicial. En los tres árboles observamos dos ramas principales que corresponden a dos grupos diferenciados de tumores según su patrón de expresión génica (en rojo, los genes sobreregulados y en verde los infraregulados). Si los genes tienen poder predictivo, las dos ramas separaran el grupo de prognosis favorable ("greater than 5 years") del de prognosis desfavorable (BRCA1 y "less than 5 years".
 

• Árbol de BRCA1: distinguimos dos patrones de expresión con bastante claridad .Uno,  en la rama izquierda donde se encuentran la mayoría de tumores tipo BRCA y una gran parte de " less than 5 years" (LT); y la otra con predominio de los de tipo "greater than five years" (GT). Es decir, el grupo de la izquierda podría asociarse con prognosis desfavorable y el de la derecha con el de prognosis favorable.
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• Árbol de ER: los dos patrones de expresión son opuestos a los del árbol anterior (los tumores con mutación en BRCA1 son ER negativos y al revés). En este árbol las diferencias entre las dos ramas se aprecian mejor, por lo que deduciríamos que son mejores como predictores. Al igual que en el caso anterior, la rama de la izquierda parece corresponderse con el grupo de prognosis favorable y la de la derecha con la desfavorable, aunque en ésta encontramos un gran número de genes LT. Esto nos indicaría que no son tan buenos predictores como cabría esperar.
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• Árbol prognosis: de nuevo se observan dos patrones de expresión, aunque no tan claramente como en los casos anteriores. Además los tumores de la rama izquierda se corresponden perfectamente con el grupo LT, siendo estos los mejores predictores de entre los tres grupos de genes.
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    En segundo lugar, compararemos los microarrays de un mismo grupo de genes en diferentes condiciones (en este caso, intentaremos ver si variando el número mínimo de tumores, las diferencias son mayores).
 

• Árboles de BRCA1: en uno de ellos el mínimo de tumores era 15 y  en el otro era 30. En ninguno de ellos podríamos distingir los dos grupos mirando el patrón de expresión;
• Árboles ER: en ambos árboles, las ramas estan bien cosntruidas y el patrón está claramente diferenciado, quizás con más precisión en cuanto aumentamos el número de tumores.
• Árboles prognosis: en ambos el patrón de expresión es parácticamente idéntico, aunque en la construcción del árbol las ramas aparecen con menos errores internos en el árbol en que hemos aumentado el número mínimo de tumores.

  Conclusiones:

    Basándonos en las tablas de porcentaje y en el análisis de los microarrays concluimos:

       A) Que los tumores se agrupan en un grupo relacionado con una prognosis favorable y otro con una prognosis desfavorable.

        B)     Que las condiciones astringentes reducen en un porcentaje importante el número de genes de nuestros sets predictivos, por lo que su valor en el diagnóstico del cáncer es bastante limitado.

        C)     Que se aprecian diferencias en la construcción de los árboles en medida del set predictivo utilizado, siendo el grupo prognosis el menos sensible a los cambios de condiciones.
 
 

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ÒNIA AGRISTÀ

AQUEL ODRIGUEZ

SABEL ORENZO

ONTSE UEVAS