Iron Response ElementS

MÉTODOS, PROCEDIMIENTO Y RESULTADO

DETERMINACIÓN DE LA ESTABILIDAD TERMODINÁMICA

Para tratar de terminar cómo de estables resultaban los IREs, utilizamos un programa denominado RNAfold (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/rnafold-simple.html) que es capaz de calcular la mínima energía libre de la estructura de mRNA. Debido a que el mRNA utiliza como molde mRNA, el código genético de las secuencias introducidas debía estar en la forma correcta. Fue por tanto necesario cambiar todas las timidinas presentes en las secuencias a residuos de uracilo. Los comandos Perl para llevar a cabo este proceso pueden verse aquí.

Hicimos una predicción tolerante de la estabilidad termodinámica ya que después de hacer una más estricta pudimos comprobar que no existían importantes diferencias. La predicción más estricta no resultó muy útil ya que aunque el patrón era más general que originariamente, los resultados del RNAfold eran similares a los de la predicción más tolerante.

El programa RNAfold nos muestra la estructura secundaria óptima de la secuencia introducida simbolizada con una notación de paréntesis y puntos, y también el valor de la mínima energía libre expresada en kcal/mol. Cuanto más negativa resulte el valor predicho por RNAfold, más estable será la estructura termodinámica. 

La estructura secundaria predicha por RNAfold es dependiente del patrón introducido en el programa para realizar la estimación. De esta forma por tanto comprobar si las estructuras predichas correspondían a IREs reales:

- Ferritinas del grupo de ensayo: no obtuvimos resultados demasiado altos (los valores de RNafold por eran demasiado negativos) debido a que en la construcción del patrón tan sólo utilizamos un único nucleótido upstream del bucle de tipo loop. La estructura secundaria habría resultado más estable si hubiéramos añadido un número mayor de apareamientos en el tallo del IRE. Dos de las secuencias presentaban valores más altos que el resto. Esto se debe a que la mínima energía libre calculada por RNAfold no corresponde a la de la estructura IRE real.

- Ferrintinas del grupo test: tal y como sucedía antes, los resultados obtenidos no eran demasiado negativos y la razón es la misma apuntada anteriormente, el patrón tan sólo contaba con un nucleótido upstream del loop medio. Si hubiéramos utilizado un número mayor de nucleótidos mayor (más negativa) habría resultado la energía. Una de las secuencias obtuvo un valor mejor que el resto pero como puede comprobarse corresponde a una estructura IRE no real.

- Transferrinas del grupo de ensayo : obtuvimos resultados altamente negativos puesto que tras el bucle C existen suficientes pares de bases apareados como para hacer a la estrucutra más estable. En este caso la mínima energía libre predicha por el programa sí corresponde a estructuras IREs reales.

- Transferrinas del grupo test: al corrrer RNAfold sobre estas secuencias obtuvimos resultados similares a las trasnferrinas del grupo de ensayo, es decir, valores bastante elevados. En esta ocasión las secuencias a través de las cuales se construyó el patrón contenían upstream del bucle C varios pares de bases.

- Aconitasas: no obtuvimos valores muy altos ya que en las secuencias a partir de las que realizamos el patrón no existían upstream del bucle C muchos nucleótidos.  Como consecuencia la estructura secundaría no resulta muy adecuada para valorar la termodinámica.

- Ferroportinas: resultados altamente negativos fueron obtenidos debido a que después del bucle C habían suficientes nucleótidos apareados para convertir a la estructura en estable termodinámicamente. La mínima energía libre de las estructuras secundarias predichas eran en todos los casos reales.

Tras la determinación termodinámica de estas estructuras (y observando que algunas de ellas no eran muy estables) quisimos comprobar si incrementando la longitud de nuestras ferritinas, los resultados de RNAfold volverían a ser los mismos o se volverían mucho más estrictos.

Repetimos todos los procesos explicados hasta el momento pero usando las secuencias elongadas:

- Inicialmente utilizamos para correr Patscan sobre las ferritinas elongadas el nuevo patrón de ferritinas, pero como este era bastante estricto (patrón no mostrasdo) solamente obteníamos las ferritinas iniciales (sin la elongación). Por este motivo lo que hicimos fue utilizar un patrón más general, procedente de la base de datos EMBL (patrón general para las secuencias de ensayo) con el que todas las secuencias de ferritinas elongadas fueron reconocidas.

- Con los nuevos resultados pudimos volver a correr RNAfold. Como era de esperar existian algunas diferencias en cuanto a los resultados de las secuencias originales y las elongadas. Podemos observar como con las secuencias más largas la estabilidad termodinámica se incrementa (RNAfold nos da valores más negativos). Los nucleótidos añadidos a las ferritias permiten por tanto que la estrucutra secundaria del IRE se vuelve más estable.

Representamos las diferencias en el siguiente gráfico: