^ORFFINDER

Autores:

Ángel Núñez Pagán

Patricia Gordillo Blanco

Beatriz del Val Romero

DESCRIPCIÓN

La función de este programa es encontrar ORFs (Open Reading Frames) en secuencias procariotas en formato FASTA, dirección FORWARD y para las 3 pautas de lectura. Concretamente sólo los ORFs que se encuentran situados entre 2 codones stop. Por tanto descartamos la parte de la secuencia desde el principio hasta el primer stop y desde el último stop hasta el final. El programa da una puntuación a cada ORF, basándose en una tabla de sesgo en el uso de codones. Finalmente devuelve los resultados en forma de tabla en un archivo .out modificable por el usuario.

____ESPECIFICACIONES____

1) Este programa está escrito en lenguaje PERL. Por tanto necesita un ordenador que tenga UNIX instalado para ser ejecutado.

2) Es muy importante introducir los parámetros, y en el orden correcto (es decir, primero el nombre del fichero que contiene la secuencia, y después el del fichero que contiene la tabla de sesgo en el uso de codones). Así mismo, se debe comprobar que tanto la tabla como la secuencia sean de DNA.

3) Es necesario cerciorarse de que el formato de la secuencia y de la tabla sean los adecuados. A la hora de bajarse la tabla de la web recomendada hay que seguir los siguientes pasos:

                          - seleccionar el organismo
                          - hacer un "submit" de la primera tabla seleccionando "standard" en format y "A style like
                            Codon Frequency output in GCG"
                          - clicar en "submit" y grabar esa tabla en un fichero .txt
                          - correr el programa TRANSFORMER con el fichero.txt para tener la tabla en el formato
                            adecuado para ORFFINDER

4) Una vez obtenido el archivo de salida de ORFFINDER, se puede filtrar para obtener en otros archivos de salida los ORFs con mayor probabilidad de ser codificantes. El umbral de aceptación es fijado por el usuario mediante comandos de UNIX, y puede aplicarse tanto al score como a la longitud de los ORFs.

5) El archivo filtrado se tiene que pasar a formato GFF para que el programa que genera el archivo en Postscript pueda trabajar con él. Ésto se consigue utilizando un comando de UNIX.

6) El archivo GFF lo transformamos a formato PS con el programa GFF2PS.

7) El archivo PS lo visualizamos gráficamente con el programa GHOSTVIEW (ejecutado desde el SHELL).

NOTA: todos los comandos de UNIX necesarios están ejemplificados más abajo.

____LINKS____

ORFFINDER
TRANSFORMER
GFF2PS
Web que contiene tablas de sesgo en el uso de codones para multitud de organismos

____EJEMPLO____

Partimos del SHELL y ejecutamos ORFFINDER con la siguiente instrucción:

./orffinder.pl secuencia.fa tabla.txt

                            El nombre de los ficheros es orientativo; se puede escoger cualquiera.
                            La entrada de la secuencia en NCBI se encuentra aquí.
                            La tabla se ha conseguido en la web recomendada en la sección anterior.

El programa correrá y nos devolverá un archivo llamado "resultados.out".

Filtramos el archivo de resultados con el comando "gawk" de UNIX. En nuestro caso hemos decidido aplicar un doble filtro para eliminar aquellos ORFs con un tamaño ($4) inferior a 200 bases y score ($5) negativo. El resultado de la aplicación del filtro lo hemos redirigido a "resultados_filtro.out".

gawk '($1 ~ /[012]/ && $4>200 && $5>0) { print $0 }' resultados.out > resultados_filtro.out

NOTA: Los parámetros del filtro son modificables.

Transformamos el archivo .out generado anteriormente en un archivo en formato GFF con el siguiente comando de UNIX, obteniendo un fichero llamado "resultados_filtro.gff":

gawk 'BEGIN{ OFS="\t" } $1 ~ /[012]/ { print $1, "orffinder", "orf", $2, $3, $5, $6, 0 }' resultados_filtro.out > resultados_filtro.gff

Ahora es necesario transformar el archivo GFF en un fichero en formato PS que podremos visualizar con GHOSTVIEW. Para hacerlo utilizamos el programa GFF2PS (puedes bajártelo desde el link que hay en el apartado anterior). El comando necesario para ejecutar GFF2PS con los parámetros por defecto es el siguiente. Redirigimos los resultados al archivo "resultados_filtro.ps".

./gff2ps -Vr -- resultados_filtro.gff > resultados_filtro.ps

NOTA: Para modificar el formato del archivo .ps que obtenemos se pueden utilizar diferentes parámetros de GFF2PS que encontrarás en el manual del usuario de la web del programa.

Para visualizar el archivo gráfico en formato PS lo abrimos llamando al programa GHOSTVIEW desde el SHELL con el siguiente comando:

ghostview -landscape resultados_filtro.ps

El archivo PS se puede pasar a JPEG con el siguiente comando (opcional):

ghostscript -dBATCH -dNOPAUSE -sPAPERSIZE=a4 -sDEVICE=jpeg -sOutputFile=resultados_filtro.jpg resultados_filtro.ps

También es opcional rotar la imagen para que la interpretación de los resultados sea más fácil:

convert -rotate 90 resultados_filtro.jpg resultados_filtro_rot.jpg

AGRADECIMIENTOS

A todos aquellos que nos han ayudado (you know who you are!)