La família de proteïnes Bcl2 es troba conservada en tots els animals i està implicada en l’alteració de la permeabilitat de la membrana mitocondrial que resulta amb la pèrdua del citocrom C i l’activació de l’apoptosi. Segons les dades experimentals, Ced9 de C.elegans (Cizeau et al.) i el cluster homòleg a Bcl2 de poríferes (Wiens M. et al.) i Drosophila (Zhang H. et al.) són versions pro-apoptòtiques. Segons Aravind L. et al. la diferenciació entre les subfamílies pro i anti-apoptòtiques deu haver sorgit amb l’aparició dels celomats ja que un dels seus ancestres ja contenia una proteïna amb funció anti-apoptòtica. Ja en vertebrats podem observar una gran diversificació de totes dues subfamílies, sobretot en la pro-apoptòtica. Aquesta tendència sembla més important en la subfamília BH3 ja que se n’han identificat moltes amb baixa similitud entre elles sobretot en mamífers. Per això que no queda massa clar si el domini BH3 és funcionalment rellevant i si tenen un únic ancestre comú. És per aquesta raó que hem descartat utilitzar aquesta subfamília per el nostre anàlisi filogenètic.

En vertebrats s’observa un creixement en la complexitat de les proteïnes i els dominis associats a l’apoptosi. En el cas de la família de Bcl2 es deu principalment a la duplicació de gens i a l’emergència de nous dominis mitjançant la modificació dels preexistents o la reorganització dels mateixos. Segons Aravind L. et al les innovacions en vertebrats en la senyalització apoptòtica i les citoquines relacionades està unida a l’evolució del sistema immunitari i més en concret a l’aparició de noves línies cel·lulars que necessiten de vies reguladores més especialitzades.

El misteri més gran en l’evolució de l’apoptosi és la presència d’homòlegs de la maquinària reguladora en bacteris (Frade JM. et al.). El fet que actinomicets i cianobacteris codifiquin per la majoria de dominis associats a l’apoptosi de la mateixa manera que ho fan els eucariotes contrasta amb la seva absència en altres tipus de bacteris com les arquees. Això suggereix l’adquisició d’aquests gens per transferència horitzontal, més probable de bacteris a eucariotes que no a la inversa.

En conclusió podem dir que l’evolució del sistema apoptòtic tendeix a l’augment de la complexitat en vertebrats en comparació amb nemàtodes i insectes i es manifesta en l’augment de proteïnes relacionades amb aquest procés. Per entendre l’origen i l’evolució de l’apoptosi s’haurien de tenir més genomes seqüenciats de les diferents branques de la vida: cianobacteris, actinomicets, eucariotes i cordats primitius.

Proteïna		BH1	BH2	BH3	BH4	TM
Bak 2 Humà		117-136	169-184	74- 88	-	188-205 (potencial)
Bak	Humà	117-136	169-184	74-88	-	188-205 (potencial)
	Ratolí	114-133	166-181	71-85	-	185-202 (potencial)
BHRF1 Epstein-barr virus		89-109	142-157	-	-	166-186 (potencial)
Bax-a	Boví	98-118	150-165	59-73	-	172-192 (potencial)
	Humà	98-118	150-165	59-73	-	172-192 (potencial)
	Rata	98-118	150-165	59-73	-	172-192 (potencial)
	Ratolí	98-118	150-165	59-73	-	172-192 (potencial)
Bax-b Humà		98-118	150-165	59-73	-	-
Bax-d Humà		49-69	101-116	-	-	-
Bcl2	Boví	126-145	177-192	83-97	10-30	202-223 (potencial)
	Hamster	133-152	184-199	90-104	10-30	209-230 (potencial)
	a Humà	136-155	187-202	93-107	10-30	212-233 (potencial)
	b humà	136-155	187-202	93-107	10-30		196-239 (potencial)
	Pollastre	130-149	181-196	87-101	10-30	208-228 (potencial)
	Rata	133-152	184-199	90-104	10-30	209-230 (potencial)
	Ratolí	133-154	184-199	90-104	10-30	209-230 (potencial)
Bcl-w	Humà	85-104	136-151	-	9-29
	Ratolí	85-104	136-151	-	9-29	-
Bcl-x	Humà	129-148	180-195	86-100	4-24	210-226 (potencial)
	Pollastre	125-144	176-191	82-96	4-24	206-223 (potencial)
	Porc	129-148	180-195	86-100	4-24	210-226 (potencial)
	Rata	129-148	180-195	86-100	4-24	210-226 (potencial)
	Ratolí	129-148	180-195	86-100	4-24	210-226 (potencial)
Bfl-1 (A1)	Humà	77-97	132-147	-	-	-
	Ratolí	77-97	132-147	-	-	-
Mcl-1 Humà		252-272	304-319	209-223	-	330-349 (potencial)
CED9 Caenorhabditis briggsae		159-179	213-228	-	80-99	-
CED9 Caenorhabditis elegans		160-179	213-229	-	80-99	-
Drob1 Drosophila melanogaster		-	-	present	-	-
Lmh-5w African swine fever virus		76-95	126-141	-	-	1-18 (potencial)
BHP1 Geodia cydonium		present	present	-	-	-
BHP1 Suberites domuncula		present	present	-	-	-

Per realitzar l’estudi filogenètic hem agafat els homòlegs que hem considerat més representatius. Hem utilitzat Bcl2 i Bclw tant d’humà com de ratolí per saber si s’havien generat abans o després de la radiació dels vertebrats; Bfl1 com a membre allunyat de la família per saber si la família sencera ja existia abans o després del mateix període.

Com a homòlegs, s’han utilitzat: Drob1 procedent de Drosophila melanogaster (Zhang H. et al.), Ced9 de Caenorhabditis elegans (Cizeau J. et al.), Bhp1 de Geodia cydonium (esponja) (Wiens M. et al.) i Lmh-5w del virus africà de la febre porcina (Neilan JG et al.).

En algunes de les cel·les de la taula que hem construït hem escrit només la paraula present. Això és degut a que no hem trobat la localització exacta d’alguns dels dominis però podem confirmar la seva existència gràcies a la bibliografia utilitzada.

Un cop escollides les seqüències, mitjançant blast i els articles científics citats a la bibliografia, hem fet l’alineament múltiple amb ClustalW i el resultat l’hem utilitzat per l’anàlisi filogenètic amb el paquet de programes Phylip: protdist, neighbor-joining, seqboot, consense. Primer hem construït un arbre amb protdist i neighbor-joining per conèixer les distàncies evolutives entre les diferents proteïnes d’aquests organismes. En un segon pas hem extret l’arbre consens a partir de les mil matrius de distàncies que provenen dels mil alineaments generats per seqboot. A la imatge veiem l’arbre consens on consten les distàncies filogenètiques obtingudes al primer pas.

L’agrupació dels membres de Bcl2 i Bclw és l’esperada, perquè tots dos pertanyen a la subfamília anti-apoptòtica de vertebrats i conserven una alta homologia. A priori crèiem que els Bfl1 es disposarien juntament amb els membres anti-apoptòtics ja que pertanyen a la mateixa família funcional, però el fet de que no sigui així pot explicar-se perquè només comparteix els dominis BH1 i BH2.

També observem que BHP1 (G.cydonium) i LMH-5W (ASFV) s’agrupen, encara que estan a una distància evolutiva considerable perquè les dues només contenen els dominis BH1 i BH2.

Sobre les proteïnes Ced9 i Drob1 no podem explicar la seva disposició raonadament: Ced9 conté BH1, BH2 i BH4 per tant és una proteïna anti-apoptòtica i Drob1 sabem que és pro-apoptòtica i podem assegurar que contindrà el domini BH3 i possiblement algun altre, encara que no hem trobat cap tipus de descripció de dominis d’aquesta proteïna. Hi ha la possibilitat que la localització d’aquestes a l’arbre sigui principalment causat per l’efecte de l’atzar, aquest fet l’expliquem en el següent punt.

El valor de bootstrap de les branques d’un arbre consens es relaciona amb la robustesa d’aquestes, és a dir, amb el grau en que l’atzar intervé en la seva disposició. En el nostre arbre, la part que ja hem comentat supera un valor de 910 (de 1000 arbres, 910 contenen aquella branca en la mateixa posició) per tant podem assegurar que el resultat és correcte i no l’hem especificat en el gràfic. El fet d’analitzar organismes molt allunyats filogenèticament, ha comportat que algunes branques tinguin valors de robustesa més baixos:

·; branques que uneixen Bfl1 i Ced9 amb la resta i la que uneix aquests dos més Drob1 amb la resta: tenen valors de 300 aproximadament. Això és degut a que la distància entre C.elegans i D.melanogaster respecte al llinatge vertebrat és considerable; tot i que el conjunt de proteïnes conservin una funció homòloga, les seves seqüències nucleotídiques poden haver-se diversificat molt. Això ha donat lloc a un alineament molt condicionat per l’atzar i uns valors de bootstrap baixos.

·; branca que uneix els Bcl2 (d’H.sapiens i M.musculus) i els BclW (d’H.sapiens i M.musculus) amb la resta de seqüències: també té un valor de 441. Això podria explicar-se pel fet que aquestes quatre seqüències són les més homòlogues de tot el grup i un intent d’alinear-les amb seqüències més llunyanes dificulta que quedin relacionades.

·; branca que relaciona les seqüències LMH-5W (African Swine Fever Virus) i BHP1 (G.cydonium) amb la resta: valor molt proper a 600. En aquest cas, pensem que el motiu torna a ser l’existència d’una gran distància filogenètica.

El fet que les branques que connecten els organismes més allunyats filogenèticament no són molt robustes ens obliga a fer més anàlisis per comprovar que realment estan relacionades evolutivament amb aquesta família i, si és així, determinar de quin membre són més homòlogues.

Hem buscat les seqüències proteiques a Swissprot dels homòlegs de Bcl2 de Epstein-Barr virus (P03182), African Swine Fever virus (Q07818), Drosophila melanogaster (Q9V9C8) i Caenorhabditis elegans (P41958). Amb cadascuna d’aquestes seqüències hem realitzat un PSIBlast i d’entre els resultats obtinguts hem buscat en quines proteïnes homòlogues de vertebrats s’observen els scores més alts.

En el cas del virus africà de la pesta porcina s’observa una major homologia amb les proteïnes Bclx de vertebrats, com per exemple el Bclx de Xenopus laevis amb el major score (50) i el mínim E-value (1e-05). Amb valors molt semblants trobem els Bclx de Bos taurus, Sus scrofa, Mus musculus.

Per altra banda, els resultats obtinguts amb Epstein-Barr virus no són concloents ja que, encara que trobem homòlegs vertebrats de la subfamília Bcl2 anti-apoptòtica, tenen uns E-values propers a 1.

En el cas de C. Elegans aquest programa troba una alta homologia (24%) entre la proteïna Ced9 d’aquest organisme i Bclw de vertebrats. Per exemple, amb el valor més alt d’score (53) i un E-value més baix (3e-06) tenim el Bclw de Rattus norvegicus, i el segueixen els Bclw de Mus musculus i Homo sapiens.

L’últim cas estudiat ha sigut el de Drosophila melanogaster. Trobem que conté una homologia d’un 34% amb BOK (de la subfamília proapoptòtica Bax) de Gallus gallus, amb un score de 103 i un E-value 2e-21.

Com podem observar els virus tenen homòlegs en vertebrats anti-apoptòtics, el sentit evolutiu radicaria en el benefici que obtenen en evitar la mort cel·lular dels seus hostes. En canvi, en D.melanogaster hem trobat que la proteïna Drob1 és en realitat un promotor de l’apoptosi, això podria explicar que la connexió d’aquesta proteïna a la resta fos dubtosa i, per tant, entendríem perquè el valor de bootstrap d’aquesta branca és tan baix.