La relació entre els nucleòtids (codons) i els aminoàcids s’estableix mitjançant les reaccions que porten a terme les aminoacil-tRNA sintetases. Com a conseqüència de la universalitat i antiguitat d’aquesta funció, es pensa que l’aparició del codi genètic precedeix la separació dels organismes en eucariotes i procariotes. Per aquest motiu, l’anàlisi filogenètic de gairebé totes les sintetases reflexa la distribució filogenètica de l’arbre universal de la vida. Però aquesta distribució no s'esdevé en l'anàlisi de la triptofanil i la tirosil-tRNA sintetases. La WRS i la YRS eucariotes estan més relacionades filogenèticament entre elles que no pas amb les corresponents WRS i YRS procariotes. Aquests resultats indiquen que les actuals WRS i YRS podrien haver aparegut després de la separació entre eucariotes i procariotes.

Aquesta família de proteïnes ha tingut molt temps per evolucionar i incorporar modificacions. Així ho demostra la gran heterogeneïtat entre els membres que componen aquesta família. Després de la separació amb Drosophila melanogaster, s’han produït diverses duplicacions dels gens donant lloc a un nombre variable de còpies per cada gen. Algunes d’aquestes còpies ja s’han perdut, però d'altres s’han conservat.
 

Tornar al índex
 

Les aminoacil-tRNA sintetases són un grup d’enzims encarregats d’activar els aminoàcids i transferir-los a les molècules del seu tRNA corresponent (primer pas en la biosíntesi de proteïnes). Són per tant un element clau en la traducció, ja que enllacen el món de les proteïnes amb el dels àcids nucleics. La importància d’aquestes molècules no només rau en la funció que exerceixen, sinó que és possible que el seu anàlisi pugui desvetllar algun dels secrets més profunds del codi genètic [5].

Cada cèl·lula conté 20 aminoacil t-RNA sintetases, una per cada aminoàcid (en eucariotes generalment hi ha dues aminoacil-tRNA sintetases per cada aminoàcid: una forma citosòlica i una forma mitocondrial). La funció que realitzen és comú per totes les proteïnes d'aquesta família, però són extremadament diverses en termes de grandària i estructura quaternària.

Les aminoacil t-RNA sintetases són unes molècules que contenen empremtes gèniques que s’extenen més enllà de l’ancestre universal de tota la vida, és per aquest motiu que el seu anàlisi és un reflex de la dinàmica de l’evolució en general. La seva filogènia molecular concorda amb la filogènia acceptada de tots els organismes (Fig.1).
 
 

Les sintetases es classifiquen en dues classes en funció dels seus dominis estructurals comuns i les seves homologies de seqüència [3]. Totes elles comparteixen en comú la seva funció general i un domini estructural anomenat WHEP implicat en la unió d'ATP. En la següent taula es pot veure la classificació de les aminoacil-tRNA sintetases.
 
 

Recentment es va poder observar que un grup d'aquesta família de proteïnes, concretament les de classe I, tenien en comú una regió conservada anomenada 'HIGH' (formada pel tetrapèptid His-Ile-Gly-His) situada a la part N-terminal de la proteïna.
Aquesta regió 'HIGH' forma part del lloc d'unió a adenilat. Les 10 aminoacil-tRNA sintetases de classe I contenen un plegament de Rossmann, caracteritzat pel motiu conservat 'HIGH' i el motiu 'KMSKS'. Les altres 10 aminoacil-tRNA sintetases de classe II estan caracteritzades per tres seqüències motiu degenerades.

A causa del seu paper central en l’establiment del codi genètic, es creu que les aminoacil-tRNA sintetases es troben entre les primeres proteïnes que van aparèixer en l’evolució. D’acord amb l’origen antic d’aquests enzims, les anàlisis filogenètiques de les seqüències de les aminoacil-tRNA sintetases mostren que aquests enzims s’agrupen segons la seva especificitat d’aminoàcid i no segons la seva posició en l’arbre filogenètic universal. Això indica que les aminoacil-tRNA sintetases van aparèixer i evolucionar abans que l’arbre de la vida es dividís en els tres dominis actualment reconeguts (Archaea, Bacteria, Eukarya).

En aquest treball es presenta una anàlisi de les relacions filogenètiques entre les triptofanil i tirosil-tRNA sintetases eucariotes i procariotes, les quals mostren un patró filogenètic totalment diferent a les relacions evolutives que presenten la resta d’aminoacil-tRNA sintetases. També s’exposa un anàlisi exhaustiu dels gens humans que codifiquen per aquesta família de proteïnes.
 
 

Tornar al índex

- Caracteritzar i conèixer una família de proteïnes molt antiga que porta milions d’anys evolucionant.

- Esbrinar les seves relacions evolutives a través de l’anàlisi filogenètic dels seus components.

- Comparar la filogènia entre la triptofanil i tirosil-tRNA sintetases (dos enzims que presenten un alt grau de similaritat estructural, la qual cosa suggereix un ancestre comú recent) i la resta de les aminoacil-tRNA sintetases.

- Fer ús de les eines informàtiques per tal d’analitzar els gens que codifiquen per aquestes proteïnes: dominis conservats, estructura exònica, etc.
 
 
 

Tornar al índex

1.-Obtenció de les seqüències

Les seqüències s’han obtingut a partir d’un document que llista les entrades de Swissprot pels 20 tipus d’aminoacil-tRNA sintetases. Aquest document també indica a quina classe pertany cada sintetasa (classe I o classe II) i si hi ha resolta l’estructura tridimensional d’algun dels membres de cada tipus.
L'obtenció dels membres de la família mitjançant la cerca per similaritat de seqüències amb el BLASTP detecta molt pocs membres degut als milions d’anys d’evolució que porten aquestes molècules. Per aquest motiu totes les seqüències s’han obtingut a partir de Swissprot.
 

2.-Anàlisi filogenètic
 

2.1.- Aliniament de les seqüències

Les seqüències han estat aliniades mitjançant el Clustalw.
En la realització del 2n arbre s’han aliniat els motius conservats 'KMSKS' característics de les aminoacil-tRNA sintetases de classe I. Com que el Clustalw no feia una bona aliniació d’aquest motiu conservat, s’ha utilitzat el programa Jalview per fer un aliniament "manual" a partir del patró de l’aliniament dels motius conservats que feia Pfam i de les referències de l'índex  bibliogràfic [4].

2.2.- Construcció d’arbres

Els arbres filogenètics s’han construït utilitzant el mètode de màxima parsimònia, a partir del paquet informàtic Phylip versió 3.5. La representació gràfica dels arbres sense arrel ha estat realitzada mitjançant el Treeview, i la robustesa de les branques ha estat obtinguda pel Seqboot, mitjançant anàlisis de bootstrap de 100 rèpliques.
 

3.-Informació genòmica: dominis conservats, estructura gènica i localització cromosòmica

Per a l’estudi dels dominis conservats de les aminoacil-tRNA sintetases s'han utilitzat les bases de dades Prosite i Interpro.
Per determinar la localització cromosòmica de les aminoacil-tRNA sintetases s’ha fet servir Ensembl.
 

Tornar al índex

1. Distribució filogenètica

La primera anàlisi s’ha realitzat a partir de l’aliniament múltiple de les seqüències senceres de diferents aminoacil-tRNA sintetases de classe I, incloses la triptofanil i tirosil-tRNA sintetases eucariotes i procariotes. L’arbre resultant (fig. 2) agrupa la WRS i la YRS segons el seu origen eucariota o procariota i no segons la seva especificitat d’aminoàcid. En canvi, les altres dues sintetases analitzades, la metionil i l’arginil-tRNA sintetasa sí que mostren una agrupació definida per la seva especificitat d’aminoàcid.

La segona anàlisi s’ha realitzat a partir de l’aliniament de les regions conservades que contenen el motiu “KMSKS” característic de les aminoacil-tRNA sintetases de classe I. Totes les seqüències aquí analitzades són WRS i YRS i inclouen sintetases provinents de genomes mitocondrials i sintetases de l’arquea A. fulgidus. L’arbre resultant mostra una clara distribució de les sintetases segons si són eucariotes-arqueas o bacterianes-mitocondrials, la qual cosa dóna suport a la hipòtesi que les WRS i les YRS actuals van aparèixer després de la separació entre eucariotes-arqueas i bacteris.

D’acord amb la teoria endosimbiòtica, les WRS i YRS mitocondrials s’agrupen amb les sintetases d’origen bacterià. En canvi, les sintetases de l’arquea s’agrupen amb les sintetases eucariotes, en concordància amb la hipòtesi que el nucli de les cèl·lules eucariotes prové d’una endosimbiosi ancestral amb un arquea (fig. 3).
 
 

       YRS i WRS eucariotes i arqueas.
       YRS i WRS bacterianes i mitocondrials.

                      Fig. 3 Arbre sense arrel de màxima parsimònia obtingut a partir de l’aliniament dels motius
                      conservats 'KMSKS' de 18 seqüències de WRS i YRS. Els números corresponen al percentatge
                      obtingut per bootstrap a cada branca particular (100 rèpliques).
                      Els noms complets de les espècies que s’hi mostren són: Neurospora crassa, Podospora anserina,
                      Bacillus caldotenax, Archaeoglobus fulgidus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis,
                     Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Bos taurus, Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus
                      i Mus musculus. Abrevacions de les sintetases: YRS, tirosil-tRNA sintetasa; WRS, triptofanil-tRNA
                      sintetasa; mit, mitocondrial.
 

2. Estudi dels gens que codifiquen per les aminoacil-tRNA sintetases humanes

A continuació s’exposa una anàlisi exhaustiu dels gens humans que codifiquen per aquesta família de proteïnes. El genoma humà conté 20 aminoacil-tRNA sintetases distribuïdes en diferents cromosomes. El nombre de gens que codifiquen per cada aminoacil-tRNA sintetasa és força variable observant-se casos amb una sola còpia del gen i casos amb 6 còpies. La llargada dels gens oscil·la entre 1.4 Mb (CRS) i 228.1 Mb (E-PRS). El nombre d’exons de cada gen també és molt variable, entre 1 (ARS) i 34 (IRS) exons. També és força destacable el fet que el gen que codifica per la prolil-tRNA sintetasa és comú amb un dels gens que codifica per la glutamil-tRNA sintetasa.
 
 

Veient aquesta taula ens adonem que el gen que codifica per la glutamil-tRNA sintetasa és comú amb el gen que codifica per la prolil-tRNA sintetasa. Aquest gen localitzat al cromosoma 1 expressa un enzim bifuncional. A continuació s'analitzen els dominis d'aquesta proteïna amb característiques tan peculiars.
 

        2.1 El cas de la E-P-tRNA sintetasa: un enzim bifuncional

S’ha observat que els genomes de certs organismes no contenen la prolil-tRNA sintetasa, la qual és essencial per dur a terme els processos de traducció de l’RNAm a proteïna. Malgrat tot, aquests organismes contenen un enzim que és capaç de realitzar l’activitat de dues aminoacil-tRNA sintetases simultàniament. La glutamil-prolil-tRNA sintetasa és un enzim bifuncional que pot aminoacetilar el seu tRNA amb àcid glutàmic o prolina. Aquest enzim només és present en organismes eucariotes superiors.

En humans i en Drosophila l’activitat de la glutamil-tRNA sintetasa (GluRS) i la prolil-tRNA sintetasa (ProRS) està continguda en una sola cadena polipeptídica, tot i que aquests enzims provenen de classes diferents i han evolucionat per camins diferents. La glutamil-prolil-tRNA sintetasa està composta per 1440 aminoàcids que provenen de 29 exons. Els exons que codifiquen per la glutamil-tRNA sintetasa i la prolil-tRNA sintetasa estan situats als extrems oposats del gen, separats per una o més còpies del domini WHEP característic d’aquesta familia de proteïnes.
 

         2.2 El domini conservat WHEP-TRS

Les diferents aminoacil-tRNA sintetases d’eucariotes superiors comparteixen en comú un domini conservat de 46 aminoàcids anomenat WHEP-TRS [2]. Aquest domini es troba entre una i sis vegades en cada enzim. En els enzims multifuncionals de mamífers se’n troben 3 còpies localitzades entre la regió N-terminal on hi ha la glutamil-tRNA sintetasa i el domini C-terminal on hi ha la prolil-tRNA sintetasa. Aquest domini WHEP també es troba en la regió N-terminal d’altres aminoacils com la triptofanil-tRNA sintetasa, la histidil-tRNA sintetasa i la glicil-tRNA sintetasa. Aquest domini WHEP conté una regió central alfa-hèlix que té un paper molt important en l’associació de les aminoacil-tRNA sintetases en complexes multienzimàtics.

El fet que diferents gens al llarg de l’evolució s’hagin fusionat donant lloc a proteïnes de fusió com la glutamil-prolil-tRNA sintetasa sembla que és una característica exclusiva dels eucariotes superiors. Aquest tipus d’organització estructural que dóna lloc a complexes multisintètics és un mecanisme que permet incorporar diferents activitats catalítiques en un sol enzim.

La seqüència patró basada en les 29 primeres posicions del domini WHEP s’exposa a continuació:
 

        2.3 Estructura exònica

L'anàlisi de l'estructura exònica de les aminoacil-tRNA sintetases humanes mostra que són molt diferents entre elles, la qual cosa recolza el fet que fa molt temps que aquests enzims estan evolucionant, cadascun pel seu camí.

Aminoacil-tRNA sintetases humanes
Classe I	Classe II
Arginina	Alanina
Cisteïna	Àcid aspàrtic
Àcid glutàmic	Asparagina
	Glicina
Glutamina
Isoleucina	Histidina
Leucina	Lisina
Metionina	Fenilalanina
Tirosina	Prolina
Triptofan	Serina
Valina	Treonina

       2.4 Variabilitat nucleotídica (SNPs) dins l’espècie humana:

Després de buscar a OMIM i a SNPs al NCBI, no hem trobat cap malaltia, ni cap mutació, que afecti, en el sentit estricte de la paraula, les aminoacil-tRNA sintetases. Això pot estranyar en un principi. Però, tenint en compte que estem parlant d’una família de proteïnes que es remunten als orígens de la vida, i que es troben a tots els organismes vius  -des de bacteris, fins els mateixos humans i arqueas- i que, com sabem, tenen un paper rellevant en l’establiment del codi genètic, hem de suposar que el seu paper com a enzims, és tan important per a la vida que qualsevol mutació que les afecti és incompatible amb la mateixa vida, o si més no, amb la vida, tal i com nosaltres l’entenem.
 

Tornar al índex

Anàlisi filogenètic

Una possible explicació d’aquests resultats és que després de l’aparició de l’ancestre de la cèl·lula eucariota, almenys un dels gens que codificaven per les YRS o WRS primitives es va perdre en la branca dels Archaea-Eukarya. Això s’hagués pogut solucionar pel reemplaçament del gen perdut per un al·lel duplicat d’una altra sintetasa (de fet, tal com s'ha explicat, hi han hagut vàries duplicacions d’aquestes molècules al llarg de la història evolutiva de les espècies). Però aquesta hipòtesi requeriria algun tipus d’explicació que actualment es desconeix sobre com un enzim funcional i essencial es pot reemplaçar per la duplicació d’un altre enzim, funcionalment diferent.

Una altra hipòtesi seria que una sintetasa ancestral fos capaç d’interaccionar amb ambdós aminoàcids i pogués unir selectivament la tirosina i el triptofan al seu tRNA corresponent (sintetases bifuncionals). Aquesta sintetasa després de la separació entre bacteris d’eucariotes-arqueas, s’hauria duplicat independentment en ambdós branques. El punt dèbil d’aquesta teoria és que requereix un esdeveniment de doble duplicació i divergència.

Tanmateix, aquests resultats demostren esdeveniments de gran dinamisme més tardans a la separació dels bacteris amb els eucariotes-arqueas, que reflexen que malgrat la importància d'aquestes molècules s'han esdevingut grans canvis.
 

Estudi dels gens que codifiquen per les aminoacil-tRNA sintetases humanes

De l’anàlisi de la localització cromosòmica i l’estructura exònica dels gens de les aminoacil-tRNA sintetases humanes se’n poden extreure unes quantes conclusions: la més evident és l’enorme diversitat que hi ha entre els diferents membres de la família, fàcilment explicable tenint en compte que es tracta d'una de les famílies de proteïnes més antigues i que per tant han tingut molt temps per evolucionar i incorporar modificacions. En segon lloc, en els casos on el nombre de gens que codifiquen per una de les aminoacils-tRNA sintetases és superior a 1, s’observa que el nombre de còpies sempre és parell (2, 4 i 6). Aquest fet podria evidenciar un origen d’aquest nombre de còpies per successives duplicacions al llarg de la història de l’evolució. En el cas de la histidil-tRNA sintetasa on s’observen 4 còpies del gen -totes elles localitzades en el cromosoma 5- les duplicacions s’haurien esdevingut fa més de 990 MA, després de la separació entre Drosophila melanogaster i Primats, ja que en el genoma de Drosophila melanogaster només se’n troba una còpia.
 

Tornar al índex

1. Bacardit M., Coll M., Gabernet N. Hostes vingueren i a sorgir ens empenyeren! Origen endosimbiòtic dels mitocondris i arbre sense arrel de tots els organismes vius, a partir de les aminoacil t-RNA sintetases. Pràctiques d’evolució, 2001.

2. Cerini C., Kerjan P., Astier M., Gratecos D., Mirande M., Semeriva M. 1991. A component of the multisynthetase complex is a multifunctional aminoacyl-tRNA synthetase. EMBO J  Dec;10(13):4267-77.

3. Eriani G., Delarue M., Poch O., Gangloff J., and Moras D. 1990. Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs. Nature 347:203-206.

4. Ribas de Pouplana, Ll., Frugier M., Quinn C., and Schimmel P. 1996. Evidence that two present-day components needed for the genetic code appeared after nucleated cells separated from eubacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:166-170.

5. Woese, C., Olsen G.J., Ibba M., Söll D. 2000. Aminoacyl-tRNA synthetases, the genetic code, and the evolutionary process. Microbiology and Molecular Biology Reviews 64: 202-236.
 
 

Tornar al índex